دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
دانشکده: علوم پايه، گروه زيست شناسي
پاياننام? کارشناسي ارشد (M.Sc)
گرايش: ميکروبيولوژي
عنوان:
ارزيابي بيان ژنهاي ?-Red در سويه هاي E.coli, Vibrio Cholerae
& Shigella dysentrieaeجهت بهينه شدن نو ترکيبي همسان
استاد راهنما:
دکترسيد محمود امين مرعشي
استاد مشاور:
دکتر رضا نظام زاده
نگارنده:
فاطمه خان بيكي
شهريور 92
سپاسگزاري
نمي دانم
چه بنويسم
چگونه بنويسم
دروصف او …
او که خدايش مي خوانند
او که با عشق، با نهايت عشق، انسان را آفريد
با چه شوقي چشمان درخشان را به انسان هديه داد تا دنيايي را که تنها براي او آفريده است ببيند
با چه شوري قلب تپنده را در وجود انسان به وديعه نهاد تا با هر تپش عشق و شور و هستي را در رگهاي انسان جاري سازد.
پروردگارا!
خود ر ا تقديم تو مي دارم، با من همان کن و از من همان ساز که خود اراده مي کني.
و در اين راه انسانهاي آگاه و آزاده را رهنمايم کن، باشد که شکرگزاري استاد راهنماي خويش جناب آْقاي دكتر سيد محمود امين مرعشي را به درستي ادا نمايم .
با سپاس از مساعدت هاي بي شائبه اساتيد گرانقدرم دكتر هاتف آجوداني ، دكتر رضا نظام زاده و سركار خانم دكتر نازيلا ارباب سليماني که زحمت بي پاياني را عهده دار شدند.
فاطمه خان بيکي
تابستان 1392
تقديم به
تقديم به پدرم اسطوره خستگي ناپذير زندگي ام
تقديم به مادرم معناي زندگي ام
تقديم به برادرم وحيد همراه هميشگي ام
تقديم به استاد عزيزم دكتر سيد محمود امين مرعشي
تقديم به همكارم ماري دارايي
و
تقديم به همه ي دوستاني كه مرا ياري رساندند.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکيده1
فصل اول: مقدمه
1-1 انتقال ژن در باکتري3
1-2 ترانسفورماسيون4
1-3 نوترکيبي5
1-4 تعريف PCR7
1-4-1 کاربردهاي PCR :10
1-4-2 تهيه ي نسخه هاي متعدد از يک ژن10
1-4-3 مراحل آزمايشگاهي PCR10
1-5 Real-Time PCR ‏11
1-5-1کاربردهاي Real Time PCR11
1-5-2 اصول کارReal Time PCR12
1-5-3روش کار Real Time PCR12
1-5-4 آناليزهاي کمي در Real time PCR13
1-5-5 روش منحني استاندارد(مقايسه مطلق)13
1-5-6 روش آستانه نسبي(مقايسه نسبي)13
1-6E.coli14
1-6-1 خصوصيات عمومي14
1-6-2 تقسيم‌هاي دوتايي و پياپي E.coli15
1-6-3 کاربردها15
1-6-4 تشخيص آزمايشگاهي باکتري E.coli16
1-7 Shigella16
1-7-1 تشخيص آزمايشگاهي باکتري Shigella16
1-7-2 بيماري زايي17
1-8 Vibrio Cholerae17
1-8-1 شناسايي و طبقه بندي18
1-8-2 فيزيولوژي19
1-8-3 عوامل موثر در بيماري زايي19
1-8-4 تأييد بيوشيميايي19
1-8-4-1واکنش بر روي محيط TS يا KIA20
1-8-4-2 تستهاي دکربوکسيلاز- دهيدرولاز20
1-8-4-3 تست نياز به نمک براي رشد20
1-8-4-4 حساسيت به ترکيب ويبريواستاتيک 129/O20
1-9 رشد و نمو باکتريها20
1-10 زمان تقسيم سلولي21
1-11 مراحل رشد و منحني رشد باکتريها21
1-12 منحني رشد باكتريايي21
1-12-1 مرحلهي خفته يا تاخيري (Lag phase)22
1-12-2 مرحله ي فعال تکثير يا رشد و تکثير لگاريتمي (Logphase)22
1-12-3 مرحله ي سکون يا تکثير کند (Stationary phase)22
1-12-4 مرحله ي زوال يا مرگ (Deathphase)23
1-13سرعت رشد و زمان نسل23
1- 14 محاسبه زمان نسل باکتري23
1-15 شيوه هاي سنجش تعداد سلول24
1-16 محيطهاي کشت25
1-16-1محيط كشت مايع25
1-16-2 محيط كشت جامد25
1-17اهداف کلي25
1-18 اهداف اختصاصي25
1-19 پرسشهاي تحقيق26
1-20فرضيه هاي تحقيق26
فصل دوم: سابقه و پيشينه
2-1 تاريخچه ترانسفورماسيون28
2-2 سيستم نوترکيبي مبتني بر?-Red29
2-3 پلاسميد PKD4630
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1 دستگاه‌ها32
3-2 موادشيميايي32
3-3 کيتها32
3-4 ميکروارگانيسم‌ها32
3-5 كشت سويه انتخابي32
3-6 Transformation33
3-7 تهيه منحني لگاريتمي34
3-8 استخراج Total RNA35
3-9 Reverse Transcriptase (RT-PCR)36
3-9-1 طراحي پرايمرهاي اختصاصي جهتReal-Time PCR36
3-9-2 Real-Time PCR (RT-qPCR)37
فصل چهارم: نتايج
4-1 استخراج Total RNA40
4-2 نتايج Real-Time PCR44
4-3 تاييد پرايمرهاي Real-Time PCR45
فصل پنجم: بحث و نتيجه گيري
5-1 بحث48
5-2 محدوديت ها52
5-3 پيشنهادات52
فهرست منابع و مآخذ53
چکيده انگليسي56
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول (3-1): دستورالعمل اجراييReal-Time PCR38
جدول(4-1 ) مقادير OD600 ويبريوکلرا در هر 30 دقيقه و تعداد کلني در واحد حجم40
جدول (4-2)مقادير OD600 Shigella در هر 30 دقيقه و تعداد کلني در واحد حجم42
جدول(4-3) مقادير OD60 0E.Coli در هر 30 دقيقه و تعداد کلني در واحد حجم فرمت43
جدول (4-4) ميانگين نتايج44
جدول(4-5) ميزان بيان ژنهاي?-Red در باکتريهاي dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae46
فهرست اشكال
عنوان صفحه
شکل (1-1) عملکرد ژنهاي exo, bet وgam بر روي DNA دو رشته اي5
شکل (1-2) نوترکيبي6
شکل (1-3) پروسه PCR9
شکل (1-4) منحني PCR14
شكل (1-5) منحني رشد باكتريايي22
شکل (4-1) منحني رشد استاندارد Vibrio Choleraeدر طول 18 ساعت41
شکل (4-2) منحني رشد استاندارد Shigellaدر طول 18 ساعت42
شکل (4-3) منحتي رشد استاندارد 0E.Coli در طول 18 ساعت43
شكل (4-4): كشت باكتري44
شکل(4-5) ميزان غلظت و خلوص RNA total بوسيله دستگاه نانودراپ45
شكل (4-6) PCR باند هاي مربوط به dnaE و ?-Red 46
چکيده
نوترکيبي همسان فرايندي است که در آن ميتوان به تحريک ژنهاي خاصي اقدام نمود که در نهايت با عملکرد جديد اين ژنها ميتوان يک ارگانيسم را به توليد يا عدم توليد يک پروتئين خاص وادار نمود. در حال حاضر تحقيقات گوناگوني وجود دارد که در آنها از نوترکيببي همسان استفاده ميشود. هرچقدر اين روشها بهينهتر گردند، مسلما فرايندهاي اقدامات آزمايشگاهي را تسهيل خواهد نمود، در نوترکيبي همسان قطعه اي از محصول PCR به داخل کروموزوم باکتري وارد شده و با استفاده از وکتورهاي ?-Red قادرخواهيم بود که ژن recA را در ميزبان تحريک کرده ونوترکيبي همسان را به انجام برسانيم. درمطالعات قبلي نشان داده شده است که طول تواليهاي انتهايي (flank) دو سر انتهاي محصولPCR نقش مهمي در انجام نوترکيبي همسان دارد، ولي انتخاب طول flank طبق قاعده و قانون خاصي نيست و محقق بايد بصورت آزمون و خطا اين طول را انتخاب نمايد. در مطالعات انجام شده بر سويه هاي استاندارد، طول اين flank ميتواند از 50 تا 2000 جفت باز متغير مي باشد.
در اين مطالعه ابتدا باکتري هاي استاندارد dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae در محيط غذايي کشت داده ميشود و سپس کلني مساوي از هر يک از باکتري ها را انتخاب و جهت استخراج totalRNA به کار ميرود. پس از تهيه total RNA آن را تبديل به total cDNA مي کنيم،. جهت تعيين وارزيابي بيان ژن ?-Red از تکنيک Real-timePCR با استفاده از SYBR green? و روش Relative استفاده نموده و ميزان بيان ژنهاي ?-Red را در هر ميزبان به دست خواهد داد. ژنهاي ?-Red وميزان بيان آن در ميزبان هاي متفاوت متغير بوده و قطعا با ارزيابي بيان آن
مي توان تا حدود زيادي طول مناسب را جهت نوترکيبي همسان تعيين کرد. در آن پايان نامه تلاش ميگردد تا فرايند انجام نوترکيبي همسان در سويه هاي باکتري dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae را تسهيل نمود. به عبارتي قرار است بررسي گردد آيا نتايج بدست آمده باعث کمک به بهبود فرايند نوترکيبي همسان ميشود يا خير؟ و واضح است که هر چه ميزان بيان ژنهاي ?-Red بيشتر باشد، بازده نوترکيبي همسان با طول کمتر flank نيز ميسرتر است.
واژگان کليدي: نوترکيبي همولوگ، ژن ?-Red، dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae

فصل اول
مقدمه

1-1 انتقال ژن در باکتري
در اكثر باكتري ها توراث ژنها اغلب به صورت عمودي است اما قسمت قابل توجهي از آن توسط انتقال جانبي يا عرضي بين باكتري ها انتقال مي يابد. عناصر ژنتيكي متحرك مثل پلاسميدها، باكتريوفاژها و ترانسپوزون ها به همراه تغييرات ژني مثل حذف، اضافه شدن و ترتيب دوباره ژن ها سير تكاملي پروكاريوتها را تسريع كرده اند و باعث ايجاد تغييرات در ژنوم باكتري ها و در نتيجه ايجاد تنوع ژنتيكي گرديده اند. باكتري ها با توجه به داشتن ژنوم كوچكتر نسبت به يوكاريوتها توانايي بيشتري براي به
اشتراك گذاشتن ژنومشان از طريق انتقال عرضي ژن توسط هم يوغي، ترانسداكشن1 و ترانسفورميشن2 دارند. مهمترين فرآيند هم يوغي است كه طي تمـاس مستقيـم سلول با سلول اتفاق ميافتد
(Proter 1997; Burrus 2006).
هم يوغي امكان تغيرات ژنتيكي بين باكتريها و گاه حتي بين سلولهاي يوكاريوتي را امكان پذير
مي سازد و اغلب توسط آن ژن هاي موجود بر روي ” پلاسميدهاي كانژوگه” منتقل مي شوند. ترانسداكشن نوع ديگري از انتقال افقي ژن است كه توسط ويروس ها و باكتريوفاژها صورت مي پذيرد. بعضي از باكتريوفاژها مي توانند به صورت يك پروفاژ به داخل كروموزوم باكتري ميزبان وارد شده و باعث ليزوژني آن شوند. پروفاژها قسمت مهمي از اكتساب افقي ژن را در DNA بسياري از باكتريها به خود اختصاص داده اند. گاهي اوقات باكتريوفاژها باعث انتقال قسمت هاي متحرك ديگري از DNA باكتري و يا قسمتي ديگر از DNA ثابت باكتري مي شوند و اين زماني اتفاق مي افتد كه خروج فاژ به صورت دقيق صورت نگيرد. اين مرحله ترانسداكشن تخصصي 3 ناميده مي شود.
سومين نحوه انتقال ترانسفورميشن است كه در آن DNA آزاد از محيط برداشته ميشود. براي پايدار ماندن DNA وارد شده به ژنوم ميزبان طي هر سه روش احتياج به يك سري مراحل حمايت كننده مثل نوترکيبي يکسان4 مي باشد. همگان قبول دارند كه اكتساب توالي هاي جديد و توسعه ژنوم امري حياتي براي تكامل ميباشند. اين که آيا ژن هاي اكتسابي در باكتري نگه داشته مي شوند و يا اين كه چگونه باقي
مي مانند بستگي به عملكرد آن ژنها و فشار انتخابي محيط براي نگه داشتن آن دارد .( Proter 1997)

1-2 ترانسفورماسيون
ترانسفورماسيون يکي از راههاي انتقال توارث به ساير باکتريها ميباشد. در اين روش يک تکه DNA دو رشته اي آزاد در محيط به سطح يک باکتري ديگر متصل شده و تنها يک رشته آن وارد باکتري شده و در کروموزوم باکتري ميزبان ادغام مي شود. براي داخل شدن قطعه اي از DNA در درون کروموزوم، عملکرد اپرون UVrABCD (UV در اول اسم اپرون مخفف پرتو UVاست ) ژن rec A بر اثر عوامل مثل uv ، عوامل شيميايي و ورود DNA تک رشته اي به درون باکتري فعال ميشود و rABCD مخفف ژنهايrecA, recB, recC و recD ميباشد) اين اپرون شامل ژنهاي recA, recB, recC وrecD ميباشد. فرآيند نوترکيبي5 بواسطه پروتئين RecA فعال ميگردد. در اين فرآيند، اگر DNAتک رشته اي وارد شده در باکتري، با ناحيه اي از کروموزوم تشابه داشته باشد، تعويض ميگردد که اين جابجايي بواسطه پروتئين RecA انجام
مي پذيرد. از طرفي ژنهايrecB, recC وrecD نقش تنظيمي، با عملکرد منفي بر روي ژن recA را بازي ميکنند(Hamood et al., 1986).
در حال حاضر، در آزمايشگاههاي تحقيقاتي، با استفاده از اين سيستم و نحوه ادغام فاژ ? وکتوري (وکتور ها مولکول‌هاي DNA اي هستند که براي کلون کردن قطعات DNA در سلول هاي ميزبان به کار مي‌روند) را توليد نموده اند که ميزان نوترکيبي را در باکتريها افزايش ميدهند. در اين وکتور سه ژن exo, bet وgam را تحت يک پروموتري که با L-arabinose تحريک مي شود قرار داده اند. عملکرد اين سه ژن بدين صورت است که پروتئين Exo باعث هضم نوکلئوتيدها از قسمت 5′ انتهاي DNA دو رشته اي
ميشود و پروتئين Bet با حفاظت از قسمت تک رشته اي 3′ بوجود آمده، مانع تخريب آن ميگردد. نهايتا پروتئين Gam با ممانعت از عملکرد ژنهاي recB,recC وrecD باعث تحريک بيان ژن recA در باکتريها مي شود (شکل1-1).
مارکر مقاومت آنتي بيوتيکي در اين وکتور آمپي سيلين بوده و از نظر تعداد پلاسميد در باکتريها، جزء پلاسميدهاي شمارش تکرار پايين6محسوب ميگردد. بهترين دما، براي تکثير اين وکتور 30 درجه سانتيگراد بوده و در دماي 42-37 درجه سانتيگراد از دست ميرود. بنابراين از اين نظر، جزء پلاسميدهاي حساس به دما7 نيز تقسيمبندي ميگردد (Yamamoto et al., 2009). مهمترين و کاربردي ترين پلاسميد در اين زمينه pKD46 بوده که قابليت تکثير، در dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae را دارد.

شکل (1-1) عملکرد ژنهاي exo, bet وgam بر روي DNA دو رشته اي

1-3 نوترکيبي
نوترکيبي8 ژنتيکي فرآيندي است؛ که طي آن مولکول اسيدنوکلئيک شکسته شده و به شکلهاي مختلف به يکديگر متصل مي شوند. اين عمل در بيشتر مواقع مربوط به DNA و گاهي درRNA نيز ديده
مي شود. نوترکيبي مي تواند بين کروموزوم هاي همولوگ باشد که به آن نوترکيبي همسان گفته مي شود. نوترکيبي به طور معمول روشي براي ترميم DNA پروکاريوت و يوکاريوت ها مي باشد که در يوکاريوت ها در ميوز رخ داده و به آن فرآيند کراسينگ اور مي گويند. در طي آن جابه جايي کروموزوم پدر و مادري رخ مي دهد و مي‌تواند سبب توليد الل جديد شود. در سيستم ايمني اين فرآيند نقش بسيار مهمي را ايفا ميکند وسبب مقاومت بدن در مقابل بيماريزاهاي مختلف مي شود.

شکل( 1-2) نوترکيبي

نوترکيبي روشي مفيد در مهندسي ژنتيک محسوب مي شود. از نوترکيبي مي توان جهت ايجاد تغيير در نوکلئوتيدهاي ژنوم باکتري ها، ويروس ها،BACs9،10PAC و پلاسميدها استفاده کرد. ولي لازم به ذکر است که نوترکيبي در محيط زنده11 نيز انجام مي پذيرد. بنابراين براي ايجاد چنين تغييري در ژنوم مي توان از نوترکيبي همسان12 استفاده کرد. در نوترکيبي همسان بايد از محصول PCR13 که انتهاهاي آن به صورت تک رشتهاي در آمده و يا از تک رشته هاي DNAسنتتيک استفاده نمود. در پروکاريوت ها ميزان ايجاد نوترکيبي طبيعي 10-5-10-4 ميباشد ولي ميزان ايجاد نوترکيبي همسان 10-1/0 درصد مي باشد. در نوترکيبي همسان مهمترين فاکتور طول قسمتهاي انتهايي محصول PCR مي باشد که به خاطر عملکرد محصول ژن bet صورت تک رشته اي در آمده است. هر چه ميزان طول ترادف هاي همسان بيشتر باشد بازده ي نوترکيبي همسان بيشتر خواهد بود. پديده ي نوترکيبي همسان به واسطه ي بيان ژنrecA در باکتري ها صورت
مي گيرد. بنابراين هر چه ميزان بيان ژن recAبيشتر باشد بازدهي نوترکيبي همسان نيز بيشتر خواهد بود (Sharan et al.,2009). نوترکيبي همسان در باکتريها بواسطه ي حضور پر رنگ بيان ژن recA صورت
مي گيرد.
بيان ژن recAبواسطه ي اپرون recBCD. (اپرون واحد عملکرد DNAژنومي است که شامل مجموعه‌اي از ژن‌هاي تحت کنترل يک سيگنال نظارتي يا پروموتر است) کنترل و سرکوب ميگردد تا از بيان افسار گسيخته ي آن جلوگيري شود. کاهش بيان ژن recA باعث کاهش ميزان نوترکيبي مي گردد. در نتيجه براي افزايش بازدهي آن به تحريک بيان ژن recA به عنوان کليد حل اين معما استفاده کرد
(Murphy et al., 2000).
سيستم نوترکيبي مبتني بر ?-Red در تغيير ژن ها بسيار سودمند ميباشد. شيوه هاي ساده اي براي غير فعال سازي و تغيير ژنها و نوکلئوتيدها در باکتريها با استفاده از تکنيک بازسازي ژنتيکي سلول وجود دارد، اين امر با کمک سيستم نوترکيبي ?-Red و محصول PCR حامل يک کاست مقاومت انتي بيوتيکي روي کروموزوم باکتري صورت مي گيرد و هر چه طول انتهاي همولوگ بيشتر باشد، بازدهي نوترکيبي همسان بيشتر خواهد بود (Yamamoto et al., 2009).
نوترکيبي همولوگ در ترميم DNAآسيب ديده در حين همانندسازي DNA موثر است. در سلولهاي يوکاريوتيک ميزان نوترکيبي همسان 8-16 درصد گزارش شده است(Saleh Gohari et al., 2005). مطالعات نشان داد که نوترکيبي همسان در باکتري , Vibrio Choleraeباعث ايجاد سويه هاي زنده ضعيف شده مي گردد. ژنهاي mer،ctxB،hlyA بواسطه نوترکيبي همسان دگرگون شده و باکتري هاي وحشي تبديل به سويه هاي کاربرديCVD109 گرديدند. در اين پروسه تواليهاي يکسان انتهايي با طولهاي متفاوت 100،500،1000 نوکلئوتيدي بررسي شده (Michalski et al.,1993). نهايتا مقالات و گزارشات نشان مي دهد که هر چه ميزان بيان ژن recA بيشتر باشد، بازدهي نوترکيبي همسان نيز بيشتر خواهد بود. ولي نکته مهم اين است که ميزان بيان ژن recA در باکتري هاي متفاوت نيزاختلاف نسبتا جزئي دارد، بنابراين ارزيابي و سنجش بيان ژن recA در بهبود و افزايش بازدهي نوترکيبي همسان مفيد واقع خواهد شد و برهمگان واضح است که فرايند نوترکيبي همسان براي ايجاد واکسن و سويه هاي زنده ضعيف شده و همچنين ارزيابي ژنهاي کنترلي مفيد خواهد بود.

1-4 تعريف PCR14
اين تکنيک در اواسط دههي 1980 بوسيله ي کري موليس معرفي شد. به دليل کاربردها و مزيتهاي بسيار زياد آن به سرعت در زيست شناسي مولکولي گسترش پيدا کرد. امروزه اين روش تقريباً در تمامي آزمايشگاهها ي زيست مولکولي جزو کارهاي متداول مي باشد و به صورت اتوماتيک بوسيلهي کامپيوتر انجام مي شود.اين تکنيک تمامي مشکلات قبلي در زيست مولکولي که ناشي از عدم دسترسي به مقادير زياد از DNA يکسان بود را برطرف کرد. براي مثال قبلاً براي بدست آوردن نسخههاي متعدد از يک ژن خاص مي بايست اين ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در يک باکتري تکثير کنند ولي امروزه اين کار را به سادگي و با استفاده از PCRانجام مي دهند. PCR به معني واکنش زنجيره اي پلي مراز مي باشد. هدف از آن سنتز رشته هايDNA جديد از روي رشته هاي الگو است که به صورت زنجير وار تکرار
ميشود. PCR داراي انواع متعددي مي باشد که يکي از آنها Real TimePCRاست. دراين روش از ژل آگارز استفاده نمي شود و امروزه با دستگاه هاي به نام لايت سايکلر15 که مقدار محصول در هر سيکل را نمايش مي دهد بسيار ساده شده است. در ساده ترين حالت از اتيديوم برومايد16 به عنوان رنگ تداخلي با DNA براي تعيين مقدار محصو ل توليد شده در هرسيکل مي توان استفاده کرد. ازآنجايي که قابليت فلورسانس اتيديوم برومايد در حضور DNA دورشته اي افزايش مي يابد، مي توان از آن براي تشخيص وتعيين مقدارمحصول دورشته اي استفاده کرد. اتيديوم برومايد تقريبا هيچ گونه اثري برروي مقدارو خصوصيات واکنش هاي PCR، ندارد بنابراين تکثير توالي هاي خاص DNA وتشخيص همزمان آن با دستگاه ترانس ايلوميناتور فرابنفش17 امکان پذير مي گردد.
PCR از نظر اصول عملي تشابه زيادي به همانند سازي DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است . ياد آوري مي شود که DNA پليمراز DNA تک رشته اي را از جهت 5َ به 3َ به عنوان الگو مورد استفاده قرار مي دهد ورشته مکمل را در جهت5َبه 3َمي سازد. همچنين DNA پليمراز براي شروع احتياج به يک قطعه اوليه (شناساگر) دارد.
براي انجام PCR ، DNAپليمراز ، نوکلئوتيد تري فسفات ها و پرايمر لازم هستند. از آنجائيکه DNA دو رشته اي است، دو نوع پرايمر درPCR موردنياز است. اين دو پرايمر دو عمل انجام مي دهند، اول اينکه محل ژني که بايد تکثير شود را مشخص مي نمايند و دوم اينکه اندازه ي قطعات تکثير شونده را تعيين
مي کنند . عمل اول کاملاَ مشخص است، در مورد عمل دوم بايد گفت که وقتي اين دو شناساگر به دو ناحيهي مختلف DNA و به سمت هم قرار ميگيرند DNA پليمراز تنها قطعات را در بين اين دو ناحيه همانندسازي ميکند و به اين ترتيب طول قطعات ساخته شده تعيين ميشود. براي شروع PCR ، DNA الگو، پرايمر ها و نوکلئوتيد تري فسفات ها و DNA پليمراز در يک لوله با هم مخلوط مي شوند. سپس لوله را گرم مي کنند تا دو رشته DNA از هم جدا شوند. سپس لوله را سرد مي کنند تا پرايمر ها به نواحي مورد نظر متصل شوند و DNA پليمراز شروع به همانند سازي از روي DNA بنمايد. بعد از مدت زمان لازم براي همانند سازي بار ديگر پرايمرها به نواحي مکمل خود متصل شوند. چون در مرحله ي قبل رشته DNA در ناحيه مورد نظر مضاعف شده است، در اين مرحله چهار رشته ي الگو براي همانند سازي وجود دارد و در نتيجه در پايان اين مرحله بوجود مي آيد، و در مرحله ي بعد 16 نسخه و به همين صورت بطور تصاعدي تعداد نسخه هاي ژن ها زياد مي شود .
در ابتداي طراحي PCR از آنزيم DNA پليمراز E.coli استفاده شد ولي اين آنزيم به حرارت حساس مي باشد و بنابراين پس از هر بار حرارت دادن محيط واکنش تا دماي 94 درجهي سانتيگراد، افزودن دوبارهي آنزيم تازه به محيط لازم بود. يکي از مهمترين کشفيات در اين زمينه اين بود که باکتريهاي
چشمههاي آب گرم داراي DNA پليمراز هايي هستند که نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتي در دماي بالا فعاليت بهتري دارند . براي مثال باکتري Thermus aquaticus داراي DNA پليمرازي است که در دماي 94 درجه ي سانتي گراد کاملاَ پايدار است و همچنين دماي اپتيمم عمل آن نيز 72 درجه ي سانتي گراد مي باشد، اين DNA پليمراز که بطور خلاصه Taq پليمراز ناميده مي شود باعث شد که براحتي PCR به صورت اتوماتيک انجام شود و با افزودن يکبار آنزيم Taq پليمراز ديگر نيازي به اضافه کردن مجدد آن نباشد .
مزيت بسيار مهم ديگر Taq پليمراز افزايش حساسيت و دقت PCR مي باشد. در دماي پايين
(30 درجه سانتيگراد) (که براي DNA پليمراز E.coli بکار ميرفت) پرايمرها ممکن است به جايگاههايي که توالي تا حدودي مشابه دارند نيز متصل شوند، زيرا در دماي پايين تعداد کمتري پيوند هيدروژني براي اتصال پرايمرها نياز است. بنابراين پرايمرها با اتصال به نواحي نسبتاَ مشابه، باعث ايجاد اشتباه در انجام مراحل PCR ميشوند. ولي وقتي که واکنش در دماي 72 درجه (دماي اپتيمم فعاليت Taq پليمراز) انجام شود اتصال پرايمر ها به نواحي غير از ناحِيهي اصلي کاهش مييابد. به اين صورت پس از پايان PCR
رشته هاي DNA کاملاَ مشابه و خالص بدست خواهد آمد. براي ديدن قطعات تکثير شده DNA ميتوان براحتي از الکتروفورز براي ژل آگاروز و رنگ اميزي اتيديوم برومايد استفاده کرد .

شکل(1-3) پروسه PCR

1-4-1 کاربردهاي PCR :
تکنيک PCR کاربردهاي نا محدودي در عرصه هاي مختلف زيست مولکولي دارد ، علت اصلي اين امر اين است که DNA الگوي بکار رفته در PCR را ميتوان از منابع مختلف تامين کرده و مورد استفاده قرار داد. بطور کلي PCR به منظور تهيه ي نسخه هاي متعدد از يک ژن و بررسي حضور يا عدم حضور يک ژن خاص در يک قطعه DNA بکار مي رود .

1-4-2 تهيهي نسخه هاي متعدد از يک ژن
براي اين کار بجاي اينکه هر دو پرايمر مورد نياز براي PCR را به يک ميزان به محيط واکنش اضافه کنند، يکي از پرايمرها را به تعداد کمتر پرايمر ديگر را به تعداد بيشتر اضافه مي کنند. در هنگام انجام PCR، در ابتدا هر دو رشته با هم همانند سازي مي کنند ولي پس از تمام شدن يکي از پرايمر ها فقط رشته ديگر که هنوز پرايمر آن وجود دارد ساخته مي شود و به همين دليل نسخه هاي بيشتري از اين رشته بوجود
مي آيد. پس از پايان PCR چند نسخه DNA دو رشته اي از ژن مورد نظر ايجاد خواهد. مثال ديگري از کاربردهايPCR بررسي پيوستگي ژنها و تعيين فاصله ي بين ژنها بر روي کروموزومهاي انسان است. در ژنتيک براي تعيين فاصله ي بين ژنها از بررسي تعداد نوترکيبها به نسبت فنوتيپ والدين استفاده مي شود. اين روش براي مگس سرکه که زادآوري آن در هر نسل بسيار زياد و دوره ي رشد آن نيز کوتاه است به راحتي قابل انجام است ولي در مورد انسان که زاده هاي آن در هر نسل بسيار محدود و با فاصله ي زماني زياد مي باشد، اين بررسي هابه سختي و با محدوديت بسيار انجام مي گيرد. ولي امروزه دانشمندان با استفاده از PCR روش جديدي را براي اين کار پيدا کرده اند.

1-4-3 مراحل آزمايشگاهي PCR:
1- واسرشت سازي دو رشته DNA: دراين مرحله DNA دو رشته اي در درجه حرارت بالا(حدود ?? درجه) به منظور به دست اوردن مولکول هاي DNA تک رشته اي، واسرشت مي شود.
?- هيبريداسيون: در اين مرحله توسط پرايمرهاي اليگونوکلئوتيدي که مکمل توالي DNA تک
رشتهاي شده هدف مي باشند در درجه حرارت حدود ?? تا ?? درجه هيبريداسيون صورت مي گيرد.
?- طويل سازي (بسط يا سنتز): در اين مرحله با يک DNA پليمراز مقاوم به حرارت مانند Taq پليمر از در درجه حرارت حدود ?? درجه سانتيگراد طويل سازي رشته صورت مي پذيرد.
اين مراحل پيدرپي تکرار مي شوند به طوري که تعداد قطعات DNA در هر سيکل دو برابر ميشوند.به قطعاتي که در هر سيکل به صورت تصاعدي افزايش مي يابند آمپليکون18 مي گويند.

1-5 Real-Time PCR ‏
به علت ورود نسل جديدي از ترموسايکلرها با سيستم فلورومتري که اجازه پايش پيوسته خاصيت فلوئورسانس محصول ‏PCR‏ در زمان جمع شدن را مي‌دهد، اين روش ابداع شد. در اين روش از کاوشگرهايا پروب‌هاي هيبريداسيون نشان‌دار شده با رنگ‌هاي فلورسانس در انتهاي ّ5 يا ّ3 استفاده مي‌شود. که امکان پايش پيوسته محصول ‏PCR‏ را بدون جداسازي آنها در روش‌ها يا الکتروفورز در ژل آگاروز يا ژل پلي آکريل آميد مي‌دهد. اين سيستم در سال 1992 کشف شد.در اين روش به دليل کاهش زمان سيکل‌هاي ‏PCR، سرعت کار نسبت به سيستم ‏PCR‏ معمولي بيشتر است.
سازندگان و کاربران اين روش سعي مي‌کنندمحصول ‏PCR‏ کوچک‌تر طراحي کنند تا سرعت افزايش يابد اما تجربه نشان داده که کاهش اندازه محصول لزوماً بازده ‏PCR‏ را بهينه نمي‌کند. البته اين روش داراي معايبي نيزاست از جمله مي‌توان به عدم ناتواني در مشخص کردن اندازه محصول بدون باز کردن سيستم و ناسازگار بودن برخي پلت فرم‌ها با شيمي برخي رنگ‌هاي فلورژنيک اشاره کرد. براي شناسايي بسياري از ويروس‌هاي عامل بيماري‌هاي انسان از اين روش استفاده شده است. درReal Time PCR ميزان محصول در هر چرخه قابل رديابي است و امکان بررسي و آناليز چند رونوشت متفاوت در يک تيوپ امکانپذير است. حساسيت و دامن? ديناميکي آن 1000 برابرPCR است؛ به کمک اين تکنيک مي‌توان ارزش گذاري کمي انجام داده و ميزان الگوي اوليه را دقيقاً تخمين زد. تفاوت Real Time PCR با PCR معمولي در اين است کهReal Time PCR توانايي تشخيص در مراحل اوليه واکنش يعني مرحله نمايي را دارد در حالي که در روش PCR معمولي از ژل الکتروفورز در مراحل پاياني يعني مرحله پلائو واکنش استفاده مي شود.

1-5-1 کاربردهاي Real Time PCR
1- تحقيقات در مورد ميزان بيان .mRNA?- اندازهگيري ميزان همانندسازي DNA در ژنوم يا DNA هاي ويروسي. ?- ميزان تأثير دارو درماني. ?- سنجش آسيبهاي DNA 5- تشخيص عوامل بيماريزا. ?- تعيين ژنوتيپ افراد. ?-سنجش تفکيک شدن آللي.
1-5-2 اصول کارReal Time PCR
تمامي اصول و واکنش‌گرهايي که براي يکRT-PCR معمولي نياز است دراين تکنيک هم بکار مي‌رود اما يک گزارشگر فلورسنت نيز در واکنش حضور دارد. اين گزارشگرها به گونه‌اي طراحي مي‌شوند که در صورت تکثير DNA نور توليد کنند. لذا افزايش شدت نور ثبت شده در دستگاه با ميزان محصول بدست آمده نسبت مستقيم دارد. با ادامه يافتن PCR شدت فلورسنت رو به افزايش مي‌گذارد. به اولين چرخه‌اي که شدت فلورسنت بيشتر از خط پايه باشد چرخ? آستانه گويند. عدد CT با مقدار الگوي اوليه رابط? معني‌دار دارد و از روي آن مي‌توان مقدار mRNA اوليه را تخمين زد. به عبارت ديگر در فاز اوليه مرحله تصاعدي مقدار فلورسنت افزايش مي يابد تا به آستانهاي مي رسد که به مقدار مشخصي از سطح background بالاتر است، اين چرخه (سيکلي از PCR که قطعه تکثير از حد آستانه عبور مي کند) به عنوان CTشناخته مي شود که دربرخي منابع با عنوان Crossing Point مطرح شده است. اين مرحله شروع نسخه برداري از قالب است که در محاسبات نتايج آزمايش استفاده ميشود.

1-5-3روش کار Real Time PCR
در اين روش از يک مولکول گزارشگر19 فلوروسنت براي مشاهده پيشرفت PCR به کار ميرود. فلوروسنت از مولکول گزارشگر ساطع ميشود که توليدات را چند برابر ميکند. بر مبناي ملکولي که براي تشخيص استفاده ميشود. در تشخيص غير اختصاصي با استفاده از رنگهاي باند شده بهDNA به عنوان گزارشگر فلوروسنت براي مشاهده واکنش PCR استفاده ميشود. اين فلوروسنت در سيکل متوالي بر اثر مضاعف شدن افزايش مي يابد. با ثبت مقدار فلوروسنت ساطع شده در سيکل، مي توان واکنش را در طول مرحله نمايي مشاهده نمود. اگر نموداري ميان لگاريتم مقدار شروع واکنش و افزايش فلوروسنت گزارشگر ترسيم شود يک رابطه خطي مشاهده خواهد شد. اغلب از SYBRGreen به همراه DNA دو رشته اي به عنوان رنگ مخصوص گزارشگر استفاده مي شود. اين رنگ به شکاف کوچک از مارپيچ دو رشته اي DNA باند مي شود. در داخل محلول, رنگهايي که باند نشده اند فلوروسنت خيلي کمي را نشان ميدهند و فلوروسنت زماني به وضوح افزايش ميبابد که رنگ به DNA دو رشته اي پيوسته شود. SYBRGreen تحت شرايط PCR پايدار وبا ثبات باقي مي ماند. سطح مطلوبي از درجه حرارت موجب تنظيم القاء و نشر طول موج ها مي شود. همان طور که پيشتر ذکر شد از اتيديوم برومايد نيز براي تشخيص مي توان استفاده کرد ولي به علت سرطان زا بودن ان کمتر استفاده مي شود.
در طراحي پرايمر، نکاتي جهت انجام واکنش Real-Time PCR در نظر گرفته شد که شامل:
– طول محصول 200-75باز
– اختلاف Tm در هر دوجفت پرايمر حداکثر 5/0 درجه سانتيگراد باشد.
– داشتن خصوصيات لازم در ساير پرايمرهاي معمولي

1-5-4 آناليزهاي کمي در Real time PCR
دو روش عمده براي بررسي کمي در Real time PCR وجود دارد

1-5-5 روش منحني استاندارد(مقايسه مطلق)
در اين روش از نمونه RNA يا DNA با غلظت مشخص براي رسم منحني استاندارد استفاده
مي شود. غلظت RNA يا DNA استاندارد با اسپکتروفوتومتر (260nm) تعيين ميشود و سپس از روي وزن مولکولي نمونه به تعداد نسخه هاي آن تبديل مي شود.استانداردهاي غلظتي ژنهاي معروف به صورت تجاري قابل خريداري است.
براي حذف نوسانات مقادير RNA وارد شده در واکنش و خطاهاي عملکرد دستگاه ها و فرد از استاندارد هاي داخلي استفاده مي شود.به اين ژن ها Housekeeping گويند. علاوه بر برپايي PCR با پرايمر اختصاصي ژن براي هر نمونه يک PCR همزمان با پرايمر بتااکتين يا GAPDH هم انجام مي شود و دادههاي هر نمونه با ژن Housekeeping همان نمونه نرماليز مي شود. سپس با استفاده از نمونه استاندارد
مي توان به نمونه مجهول پي برد.

1-5-6 روش آستانه نسبي(مقايسه نسبي)
در اين روش نيازي به رسم منحني استاندارد نيست. و مقدار نرماليز شدهCT نسبت به يک نمونه تيمار نشده سنجيده مي شود. در اين روش نيز به استاندارد هاي داخلي نيازمنديم.و بايد مقدار CT آن ها از مقدار CT نمونه مورد نظر کسر گردد (نرماليز کردن).
تفاوت نسبي نمونه آزمايش در مقابل کنترل محاسبه مي شود.
CT عبارتست از C ژن هدف (کاليبراتور) که از C ژن Housekeepin کسر شده است.

شکل( 1-4) منحني PCR

1-6E.coli
Escherichia coli که بطور اختصار E.coli نيز ناميده مي‌شود، نوعي باسيل گرم منفي از خانواده انتروباکترياسه‌است که بطور شايع در روده جانوران خونگرم وجود دارد. بيشتر سويه‌هاي E.coli، بي‌آزار هستند اما برخي از سروتيپ‌ها موجب مسمويت غذايي و اسهال مي‌شوند(مرکز جهان20CDC). اين سويه‌هاي بي‌آزار، بخشي از فلور عادي روده هستند. آن‌ها در توليد ويتامين K وB نقش دارند و از استقرار باکتري‌هاي بيماريزا در روده جلوگيري مي‌کنند. اين باکتري، 1/0% فلور روده را به خود اختصاص داده‌است. اين باکتري از طريق مسير مدفوعي-دهاني21‏ از يک فرد به فرد ديگر منتقل مي‌شود.

1-6-1 خصوصيات عمومي
هر گرم از مدفوع انسان حاوي بيش از 108 باکتري E.coli مي باشد.c. E.coli به خوبي روي محيط هاي خيلي ساده رشد مي کند، و متحرک مي باشد. لاکتوز را تخمير مي کند و درخشندگي سبزرنگي روي محيط EMB(جلاي فلزي) تشکيل مي دهد.
اين باکتري داراي فعاليت ليزين دکربوکسيلاز22بوده و مي تواند استات را به عنوان تنها منبع کربن استفاده نمايد و قادر به هيدروليز تريپتوفان مي باشد. اين باکتري23MUG مثبت است. اين باکتري پس از 10 دقيقه در 70°C از بين مي رود. نسبت به مقادير زياد املاح صفراوي ـ سلينت F حساس است. رنگ هاي مالاشيت گرين و بريليانت گرين از رشد اين باکتري جلوگيري کرده و از اين مواد براي تهيه محيط هاي انتخابي پاتوژن ها استفاده مي گردد. E.coli به عنوان يک پاتوژن کليدي در عفونت هاي بيمارستاني مطرح است و هم چنين عامل ايجاد کننده عفونت هاي مجاري اداراي کسب شده از جامعه نيز مي باشد.

1-6-2 تقسيم‌هاي دوتايي و پياپي E.coli
E.coli، باسيل گرم منفي، متحرک و بي‌هوازي اختياري و بدون اسپور است. اين باکتري در شرايط بي‌هوازي، مخلوطي از اسيدها مانند لاکتات، سوکسينات، اتانول، استات و دي اکسيد کربن را توليد مي‌کند رشد بهينه باکتري در دماي ?? درجه سانتي‌گراد است اما تا دماي ?? درجه را نيز تحمل کرده و به رشد خود ادامه مي‌دهند (Fotadar et al., 2005).E.coli، هم در شرايط هوازي و هم بي‌هوازي مي‌تواند رشد کند. سويه‌ها داراي تاژک هستند و به خاطر همين، متحرک هستند. تاژه‌ها متعدد و از نوع پيراموني24 ‏هستند (Darnton et al., 2007). E.coli و باکتري‌هاي مشابه آن، با استفاده از مکانيسم‌هايي مانند ترانسفورماسيون، هم يوغي(کانژوگاسيون) و ترانسداکسيون، ماده ژنتيکي خود را از راه انتقال افقي ژن‌ها به ساير باکتري‌هاي مشابه خود منتقل مي‌کنند. به عنوان مثال، انتقال ژن توکسين شيگا از ShigellaبهE.coli O157:H7 از طريق فاژ (ترانسداکسيون) اتفاق افتاده‌است (Brussow 2004).

1-6-3 کاربردها
E.coli نخستين جانداري بود که باروش‌هاي مهندسي ژنتيک مورد دستکاري ژنتيکي قرار گرفت. از E.coli براي کلونينگ25و بيان بسياري از ژن‌ها و توليد محصولات نوترکيب استفاده شده‌است به عنوان مثال، با استفاده از مهندسي ژنتيک، دانشمندان توانسته‌اند از E.coli، انسولين توليد کنند. همچنين از E.coli‌ هاي تغيير يافته براي توليد واکسن و زيست پالايي نيز استفاده شده‌است (Comelis etal., 2000). از E.coli به عنوان يک ارگانيسم مدل در پژوهش‌هاي ژنتيکي استفاده مي‌شود. به عنوان مثال، اولين بار پديده هم يوغي(کانژوگاسيون)در آن ديده شد و هنوز هم در تحقيقات از آن استفاده مي‌شود (Lederberg 1946) براي بررسي اثرات فاژ بر باکتري‌ها، اولين بار از E.coli استفاده شد.

1-6-4 تشخيص آزمايشگاهي باکتري E.coli
E.coli بر روي محيط آگار مک کانکي26، کلني‌هاي ارغواني



قیمت: تومان


پاسخ دهید