دانشگاه آزاد اسلامي
واحد اروميه
دانشکده علوم پايه
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد
رشته : زيست فناوري (بيوتکنولوژي)
گرايش : ميکروبي
عنوان :
شناسايي و بررسي حضور باکتري هاي بي هوازي نفت زي قادر به استفاده از نفت خام به عنوان تنها منبع کربن ، انرژي و ازت
استاد راهنما :
دکتر ميترا السادات طباطبايي
استاد مشاور :
دکتر مجيد نوجوان
نگارش :
فريبا مودب
زمستان 93
چکيده
حضور وسيع باكتريهاي بي‌هوازي و آركي‌ها در سيستم نفتي زيرزمين به وسيله بسياري از مطالعات مورد بررسي قرار گرفته است. فرآيندهاي آرام بي‌هوازي در زير زمين فراوان مي‌باشد كه به همراه تجزيه زيرزميني هيدروكربن‌ها كه در ارتباط با احياي نيترات و متانوژنز و يا در مخازن نفتي در جائيكه وفور سولفات وجود دارد، به همراه احياي سولفات است. ميكروارگانيزم‌هايي كه قادر به استفاده از نفت خام به عنوان تنها منبع انرژي و كربن مي‌باشند، با توليد يكسري محصولات جانبي و يا با شكستن تركيبات هيدروكربني سنگين كمك شاياني در رفع مشكلات موجود در صنعت نفت کرده اند.
در اين مطالعه باکتري هايي از منطقه ي لاوان ، سکوي سلمان واقع در استان خوزستان جداسازي شدند که داراي قابليت استفاده از هيدروکربن هاي ازته به عنوان تنها منبع کربن، ازت و انرژي بطور موثر بود. تحقيقات نشان مي دهد که اين باکتريهاي بي هوازي قادرند برخي ترکيبات کمپلکس ، حلقوي و خطي نفت خام را تجزيه کرده و از ازت موجود در اين ترکيبات استفاده کنند. هدف از اين مطالعه بررسي باکتري هاي مصرف کننده نفت خام به عنوان تنها منبع انرژي ، ازت و کربن و تجزيه ي آن به مواد قابل بازيافت و تعيين شرايط بهينه ي رشد آنها مي باشد. نمونه ها پس از نمونه گيري در کمترين زمان ممکن به آزمايشگاه منتقل شدند و در محيط هاي رشد مناسب کشت داده شدند. در ابتدا براي بي هوازي کردن محيط کشت از روش Hungate استفاده کرده و با استفاده از serum bottle وcrimped seal کردن و در نهايت تنظيم گاز، محيط رشد باکتري ها به صورت بي هوازي تهيه شدند. نمونه ها در محيط کشت BSM کشت داده شدند سپس به دليل fastidious بودن باکتري هاي بي هوازي در محيط کشت MSM که يک محيط حداقل نمکي مي باشد و حاوي 1? نفت خام استريل به عنوان منبع کربن بود کشت صورت گرفت. غني سازي نمونه ها با افزودن 0.01? گلوکز و نيز محلول ويتامين ها و Trace mineral به محيط کشت انجام شد. استفاده از محيط کشت اختصاصي نيترات براث براي کشت باکتري ها در اين مرحله صورت گرفت تا از ساير باکتري هاي بي هوازي رشد کرده در محيط جدا شوند. در محيط نيترات براث پس از مشاهده ي تغيير رنگ محيط کشت از وجود باکتري هاي تجزيه کننده ي نيترات (NRB ) اطمينان حاصل شد. در مراحل بعد براي جدا کردن کلني به دليل عدم دسترسي به گلاو باکس ميکروبي کشت در محيط کشت شيب دار با استفاده از serum bottle و جوشاندن محيط کشت براي خارج کردن اکسيژن محلول در آن و تنظيم گاز با purge کردن گاز ازت در آن به صورت بي هوازي کشت انجام شد. اضافه کردن محلول ويتامين ها نيز در همه مراحل کشت انجام شد. تست احياي نيترات جهت انتخاب بهترين سويه در شرايط بي هوازي و رشد در محيط غني شده انجام شد و جهت بررسي عملکرد باکتري روي ساختار نفت و چگونگي تغييرات ايجاد شده در ساختار نفت توسط باکتري هاي NRB جدا شده، از تست CHN استفاده شد تا کاهش مقدار ازت مشخص گردد.
کلمات کليدي : نفت خام ، باکتري احيا کننده نيترات ، بي هوازي ، پر نياز ، باکتري احيا کننده سولفات

تقديم به
مادرم
که راز جاذبه است و اولين چراغ زندگي ام
پدرم
که شهر فاضله ي قلب من است
خواهرم و برادرانم
که حضورشان دلگرمي مرا کافيست
تقدير و تشکر
از زحمات بي دريغ استاد راهنما سرکار خانم دکتر ميترا السادات طباطبايي و راهنمايي هاي موثر استاد مشاور جناب آقاي دکتر مجيد نوجوان
فهرست مطالب
فصل اول
کليات

1-1مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………..2
1-2 اجزاء نفت خام……………………………………………………………………………………………………..4
1-3 اهداف کلي و جزئي………………………………………………………………………………………………7
1-4 اهميت شناسايي و بررسي منابع نفتي………………………………………………………………………….9
1-5 فرضيه هاي تحقيق………………………………………………………………………………………………..10
1-6 سوالات تحقيق……………………………………………………………………………………………………11
فصل دوم
پيشينه پژوهش
2-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………13
2-2 نظريه منشاء آلي نفت………………………………………………………………………………………….15
2-3 ميکروبيولوژي نفت………………………………………………………………………………………………17
2-3-1 ارتقاء کيفي…………………………………………………………………………………………………….19
2-3-2 ارتقاء کمي…………………………………………………………………………………………………….20
2-4 ارتقاء زيستي يا Bio upgrading ……………………………………………………………………….21
2-5 توليد اوليه نفت…………………………………………………………………………………………………..21
2-5-1 توليد اسيد آلي که منجر به انحلال سنگهاي کربناتي و توسعه کانال ها مي شود………….21
2-5-2 احياي گوگرد ونيترات در ترکيبات گچي و انيدريدي و مواد معدني سولفاتي که نفت
به دام افتاده در آنها را آزاد ميکند………………………………………………………………………………..22
2-5-3 توليد گازهايي از قبيل متان، دي اکسيدکربن،هيدروژن و نيتروژن که نفت را از فضاهاي
مرده به خارج مي رانند………………………………………………………………………………………………22
2-6 تجزيه بيولوژيک نفت………………………………………………………………………………………….23
2-7 اثرات سوء آلودگي هاي نفتي تحت تاثير برخي عوامل مهم به شرح زير قرار ميگيرند………23
2-7-1 حجم نفت……………………………………………………………………………………………………..23
2-7-2 نوع نفت………………………………………………………………………………………………………..24
2-8 آلودگي هاي نفتي………………………………………………………………………………………………24

فصل سوم
روش کار

3-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………26
3-2 هدف کاربردي اين بخش……………………………………………………………………………………27
3-3 دستگاه ها و وسايل مورد استفاده…………………………………………………………………………..27
3-4 مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………28
3-5 روش کار…………………………………………………………………………………………………………29
3-5-1 مرحله اول……………………………………………………………………………………………………31
3-5-2 مرحله دوم روش تلقيح و کشت باکتري ……………………………………………………………32
3-5-3 مرحله سوم روش رنگ آميزي منفي…………………………………………………………………33
3-5-4 مرحله چهارم روش رنگ اميزي گرم………………………………………………………………..34
3-5-5 مرحله پنجم شروع غربالگري پس از هفته هشتم………………………………………………….34
3-5-6 مرحله ششم محيط کشت اختصاصي جامد براي جداسازي باکتري احيا کننده نيترات .35
3-5-7 مرحله هفتم روش تهيه سريال رقت…………………………………………………………………..35
3-6 تست احياي نيترات……………………………………………………………………………………………37
3-7 تست CHN ……………………………………………………………………………………………………37
3-7-1 خلاصه اي از ويژگي هاي تست CHN ……………………………………………………………38
3-8 غربالگري در محيط کشت غني شده BHI ……………………………………………………………39
فصل چهارم
نتايج
4-1مشاهدات ميکروسکوپي……………………………………………………………………………………41
4-2 غني سازي……………………………………………………………………………………………………..41
4-3 نتايج کشت اختصاصي نيترات براث……………………………………………………………………42
4-4 نتايج تست احياي نيترات………………………………………………………………………………….42
4-5 نتايج کشت در محيط BHI………………………………………………………………………………43
4-6 نتايج تست CHN …………………………………………………………………………………………..44
4-7 تفسير نتايج تست CHN ………………………………………………………………………………….45
فصل پنجم
بحث و نتيجه گيري
5-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………….48
5-2 بيوتکنولوژي و اهميت بيوتکنولوژي نفت…………………………………………………………..48
5-3 بحث…………………………………………………………………………………………………………..52
5-4 نتيجه گيري………………………………………………………………………………………………..55
5-5 پيشنهادات………………………………………………………………………………………………….56
پيوست الف ………………………………………………………………………………………………………57
منابع فارسي……………………………………………………………………………………………………….58
منابع انگليسي……………………………………………………………………………………………………..58
فهرست جداول
جدول 1-1 نسبت ترکيبي نفت خام………………………………………………………………………………………………………..3
جدول 4-1 مقادير آناليز عنصري در نمونه شاهد…………………………………………………………………………………..44
جدول 4-2 مقادير آناليز عنصري در نمونه MSM ……………………………………………………………………………..45
فهرست نمودار
نمودار1-1 قيمت هاي نفت خام به صورت واقعي و صوري …………………………………………………………………10

فصل اول
کليات
1-1 مقدمه
نفت خام کمپلکس ترکيبي است که بطور عمده از هيدروکربن هاي متغير اشباع شده و اشباع نشده تشکيل شده است. بيوتکنولوژي نفت مجموعه اي از متد و روش ها براي توليد، تغيير و اصلاح فراورده ها و توليد ميکروارگانيسم ها براي کاربردهاي ويژه است. مثلا تحقيقات در زمينه ي MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery) بمنظور افزايش برداشت از چاه هاي نفت به روش هاي ميکروبي به منظور استخراج بيشتر نفت مي باشد . ميکروارگانيسم ها ابزار اصلي تحقيق در زمينه ي بيوتکنولوژي هستند که شامل باکتري ها، قارچ ها، جلبک ها وميکروب هايي که در حوزه ي نفت در فرآيندهاي پالايش-انتقال-تغيير و تبديل مواد ،محيط زيست و خوردگي از ابزارهاي اصلي بشمار مي روند مي باشند. که اين منوط به حفظ و نگهداري ميکروارگانيسم ها بدون کمترين تغيير ژنتيکي ميباشد. در بخش مطالعات مخزن در ايران براي اولين بار مطالعه ي مخزن آزادگان با يک شرکت نروژي Sintef انجام شده روي سه ميدان بزرگ نفت مارون، بي بي حکيمه و اهواز مشترک با شرکت نروژي استات اويل مطالعه شده. از 6/3 ميليون بشکه نفت 5/1 ميليون بشکه از اين سه ميدان تامين شده است. مطالعه جامع ميدان (F.F.S ) و توسعه ي ميدان ( M.D.D ) روي اين زمينه فعاليت مي کنند. مطالعه ي ديگر با شرکت روسي تاتنفت در زمينه ي ازدياد برداشت به روش ميکروبي ميباشد که کار بزرگ و منحصر به فردي است. در ايران 3 منطقه ي نفتي وجود دارد: زاگرس ، منطقه ي ايران مرکزي و منطقه ي کپه داغ که ايران مرکزي در فارس و شمال بندر عباس و کپه داغ در شرق گرگان و شمال شرق ايران قرار دارد. نفت خام ايران متشکل از مواد آلي است که قسمت اعظم آن کربن و هيدروژن همراه با مقادير کم گوگرد ، ازت ، اکسيژن و مقادير جزئي فلزات از جمله نيکل ، واناديوم و…. ميباشد. ( جدول 1-1 )
(جدول 1-1) نسبت ترکيبي نفت خام
عنصر حداقل درصد وزني حداکثر درصد وزني کربن 2/82 1/87 هيدروژن 8/11 7 / 14 گوگرد 1/0 5/5 اکسيژن 1/0 5/4 نيتروژن 1/0 5/1
جهت مقايسه ي انواع نفت خام نمي توان از آناليز ترکيبات تشکيل دهنده ي آن استفاده کرد. بدين منظور از آزمايشات استانداردي استفاده ميشود که تعيين کننده ي قيمت نفت خام خواهد بود ( 7 ).
کلمه ي نفت که در زبان انگليسي Petroleum ناميده مي شود از دو کلمه ي petra و oleum که در زبان يوناني به ترتيب به معني سنگ روغن و يک نوع روغن مي باشند تشکيل شده است . منابع انرژي در طبيعت شامل نفت، زغال سنگ، انرژي هسته اي، انرژي الکتريکي و غيره مي باشد. با توجه به محدوديت منابع انرژي و اهميت صرفه جويي در مصرف و آلودگي هاي زيستي ناشي از ان تحقيقاتي در زمينه ي علوم مختلف جهت مصرف بهينه و کاهش آلودگي هاي محيط زيست انجام شده است. به مجموعه تست هايي که شناسه ي نفت خام را مشخص ميکنند crude assay گفته ميشود. از جمله اين خواص : اندازه گيري وزن مخصوص ، گوگرد ، نمک ، آب و مواد رسوبي ، گرانروي ، نقطه ي ريزش ، محدوده ي تقطير ، ناخالصي هاي فلزي و کربن باقي مانده ميباشند. درجه ي API نفت خام در اکثر موارد بين10 تا 45 مي باشد و به ندرت کمتر از 10 يا بالاتر از 50 ميباشد.
نفت خام سنگين: با درجه API 10 الي 20
نفت خام متوسط: با درجه API 20 الي 30
نفت خام سبک: با درجه API بيش از 30
در يک دسته بندي کلي محصولات حاصل از نفت خام ايران شامل:
1-سوخت هاي گرمايشي
2-سوخت ماشين هاي درون سوز
3-حلال ها
4-روغن هاي روان ساز
5-مواد اوليه ي صنايع پتروشيمي و شيميايي
6-آسفالت و قير
نفت در دماي بالاتر از 200 درجه سانتي گراد حضور ندارد و هيدروکربن ها در اين دما متلاشي مي شوند. (شکسته ميشوند) نفت ممکن است بوسيله ي تجزيه ي باکتريايي دگرسان شود . تجزيه ي باکتريايي سبب سنگين تر شدن و گرانروي بيشتر نفت مي شود. جريان آبهاي زيرزميني و فعاليت باکتريايي باعث تشکيل نفت سنگين ميشود ( 1 و 2 ).
1-2 اجزاء نفت خام
نفت خام يا پتروليوم نوعي سيال است که بصورت مجموعه اي از هيدروکربن هاي مختلف به اشکال مايع يا گاز در مخازن زيرزميني وجود دارد. پتروليوم در شيمي و زمين شناسي اصطلاحا به ترکيب هيدروکربني اطلاق ميشود که توسط چاه هاي نفت از داخل زمين استخراج ميشوند. تصوير اصلي پتروليوم در داخل مخازن به صورت گاز است که به نام گاز طبيعي ناميده ميشود. بخشي از پتروليوم در شرايط متعارفي ( دماي 15 درجه سانتي گراد و فشار 760 ميلي متر جيوه ) به صورت مايع درآمده که به آن نفت خام مي گويند و بخش ديگر به همان صورت گاز باقي مي ماند. نفت و فراورده هاي آن از زمان هاي بسيار قديم مورد استفاده قرار گرفته است. اين ماده را از قرن ها پيش به صورت گاز در آتشکده و يا به فرم قير مي شناختند بطوريکه در کتب مقدس و تاريخي اشاره شده که در ساختمان برج بابل از قير استفاده گرديده است. کشتي نوح و گهواره ي موسي نيز به قير اندود بوده است. علاوه بر اين بابلي ها از قير به عنوان ماده قابل احتراق در چراغ ها و تهيه ي ساروج جهت غير قابل نفوذ نمودن سدها و بالاخره جهت استحکام جاده ها استفاده مي کردند. همچنين نادر شاه با استفاده از روشن کردن مشعل هاي نفت موفقيت چشمگيري در فتح هندوستان بدست آورد. اولين چاه نفت در سال 1859 در يک ساختمان تاقديسي در ايالت پنسيلوانياي آمريکا حفر گرديد. در ايران هم اولين چاه نفت در سال 1902 در تاقديس مسجد سليمان به ثبت رسيد. بيشتر توليدات نفتي تا نيمه ي قرن نوزدهم از طريق چشمه هاي نفتي با گودال هاي کم عمق و چاه هاي دستي حفر شده در مخازن نفتي کم عمق صورت گرفت. حفاري هاي نسبتا عميق جهت استخراج نفت در ابتدا در ناحيه ي پچل بورن فرانسه انجام شد. در اين ناحيه ماسه هاي نفتي در زمين بطور قابل ملاحظه اي گسترده شده است. با شروع جنگ جهاني اول ( 1918_1914) نياز به مواد نفتي به شدت افزايش يافت (5).
اجزاء تشکيل دهنده ي نفت خام را مي توان بر اساس کروماتوگرافي جذب سطحي به چهار جزء اشباع شده، آروماتيک، رزين و آسفالتين تفکيک کرد. هر کدام از اين 4 گروه تعداد زيادي از ترکيبات مختلف را شامل ميشوند. هيدروکربن هاي اشباع شده ترکيباتي هستند که هيچ پيوند دوگانه اي در ساختار خود ندارند. اين هيدروکربن ها را ميتوان بر اساس ساختار شيميايي به دو گروه آلکان ها ( پارافين ها ) و سيکلوآلکان ها ( نفتن ها ) تقسيم بندي کرد. آلکانها خود مي توانند زنجيره هاي انشعاب دار يا بدون انشعاب ( نرمال ) باشند و فرمول کلي CnH2n+2 را دارند. سيکلوالکان ها داراي يک يا تعدادي حلقه کربني ( معمولا سيکلوپنتان يا سيکلوهگزان) در ساختار خود هستند و فرمول کلي CnH2n دارند. اغلب آلکان هاي موجود در نفت خام داراي استخلاف آلکيل مي باشند. آروماتيک ها يک يا چند حلقه آروماتيک با يا بدون استخلاف آلکيل دارند. بنزن ساده ترين آنهاست ولي در نفت خام ترکيبات آروماتيک حاوي استخلاف آلکيل عموما از انواع بدون استخلاف بيشتر هستند. بر خلاف هيدروکربن هاي اشباع شده و آروماتيک، آسفالتين ها و رزين ها هر دو در ساختارشان داراي گروههاي قطبي غيرهيدروکربني هستند و عناصر سازنده ي آنها علاوه بر کربن و هيدروژن شامل مقادير ناچيزي ازت، گوگرد و يا اکسيژن نيز مي باشد.
اين گروهها اغلب با فلزات سنگين کمپلکس مي دهند. آسفالتن ها از ترکيبات سنگين مولکولي تشکيل شده اند که در حلال هايي نظير هپتان_n حل نمي شوند در حاليکه رزين ها مولکول هاي قطبي محلول در n_هپتان مي باشند. رزين ها شامل ترکيبات ناجور حلقه، اسيدها و سولفونيک ها هستند. انواعي از محصولات نفتي بوسيله ي فراوري نفت خام توليد مي شوند. اين فرآوري اساسا يک فرآيند تقطير جزء به جزء است که بوسيله ي آن اجزا يا بخشهاي مختلف نفتي توليد مي شوند. در اين مطالعه آن دسته از ترکيبات اعم از خطي يا حلقوي مورد بررسي قرار ميگيرند که داراي ازت به عنوان ترکيب سازنده آن مي باشند ( 13 ).
( شکل1-1 ) نمونه اي از ساختمان رزين ـ آسفالتين
1-3 اهداف کلي و جزئي
اهداف کاربردي و کلي اين تحقيق شامل استخراج باکتري احياء کننده ي نيترات از نفت ميباشد لذا اثر اين باکتري در نفت و استفاده از آن در صنعت و تاسيسات را تحت تاثير قرار ميدهد. شناسايي باکتري هاي بي هوازي احيا کننده نيترات موثر در اين کار بخش ديگري از اين تحقيق بشمار مي رود زيرا ممکن است در طي مراحل آزمايش باکتري هاي مقاوم به حرارتي را شناسايي کنيم که قبلا روي آنها بررسي صورت نگرفته است. به دليل اينکه هرچه عمق مخزن بيشتر باشد حرارت افزايش مي يابد و باکتري بدست آمده مقاوم تر ميباشد( 8 ).
عمق اکثر مخازن نفت بين 900 تا 5000 متر است و گاهي چاه ها 7 الي 8 کيلومتر عمق دارند و اکثرا عمودي هستند. از اهداف کاربردي تحقيقات بيوتکنولوژي نفت در صنايع مي توان به دسته بندي محصولات پتروشيمي که شامل محصولات اصلي مثل اتيلن ، گوگرد ، آمونياک و… و محصولات فرعي مثل پلي کلروروينيل ( PVC ) و ملامين و در نهايت الياف مصنوعي ، کودهاي شيميايي و غيره اشاره کرد. صنايعي که از محصولات پتروشيمي و يا توليدات پالايشگاههاي نفت به عنوان مواد اوليه استفاده مي نمايند صنايع پايين دستي پتروشيمي شناخته مي شوند.
صنايع پايين دستي در دو حيطه ي زير بررسي مي شوند:
-محصولات مصرفي نهايي ( End-use)
-مواد حد واسط ( مواد اوليه مورد نياز براي توليد محصولات نهايي)
اهداف اين بخش و کاربرد صنايع پايين دستي شامل: تدوين برنامه ي جامع توسعه صنايع پايين دستي پتروشيمي ، حمايت از سرمايه گذاري در صنايع پايين دستي ، آسيب شناسي صنايع پايين دستي ، تهيه و فرمولاسيون کودهاي آلي ، بازيابي و تبديل ضايعات نفتي به مواد کاربردي ، تبديل فراورده هاي پتروشيمي به محصولات با ارزش ، کمک به ايجاد نهادهاي مالي توسعه صنايع پايين دستي پتروشيمي (10 ).
توسعه ي فعاليت بخش خصوصي در حوزه ي پايين دستي مرتبط با نفت و پتروشيمي و ارتباط بهتر صنايع بالا دستي و پايين دستي نفت ضمن ايجاد ارزش بالاتر و اقتصاد بهتر زمينه را براي رقابت با توليدات داخلي در بازار جهاني فراهم خواهد کرد. نتايج حاصل از اين تحقيق قابل استفاده در صنايع مرتبط با صنعت نفت و محيط زيست مي باشد. چنانچه در فرايندهايي مثل ازدياد برداشت ميکروبي نفت، سبکسازي نفت هاي سنگين، پاکسازي خاکها و آبهاي آلوده به هيدروکربن هاي نفتي قابل استفاده است. خصوصا در کشوري مثل ايران که مبحث آلاينده هاي نفتي در محيط هاي آبي و درياهاي جنوب و شمال ايران و خاک هاي اطراف پالايشگاهها بررسي اين موضوع مهم ميباشد. در اين تحقيق هدف جداسازي باکتري هاي بي هوازي NRB است که ازت را از ساختارهاي پيچيده ي نفتي ( آسفالتين و رزين ) بيرون کشيده و آنها را به ترکيبات خطي تبديل ميکند که مي تواند مورد استفاده و مصرف ساير باکتري ها قرار بگيرد.
اين کار همچنين براي اهداف زيست محيطي مناسب مي باشد. از جمله باعث بالا رفتن درجه API نفت خام مي شود و نفت سنگين را به نفت سبک تبديل کرده و نيز در حذف آلاينده ها و پاکسازي آلودگي هاي نفتي موثر مي باشد ( 12 و 15 ) .
1-4 اهميت شناسايي و بررسي منابع نفتي
نفت و ساير مواد سوختي هيدروکربني به صورتي که ما امروزه آن را مي شناسيم در مخازني در اعماق زمين وجود دارند. اين مواد در ابتداي کشف به صورت منبع بسيار مهم انرژي تلقي شدند ليکن با پيشرفت علم و تکنولوژي مدرن خواص ديگر آنها نيز مورد توجه قرار گرفت و شايد امروز بتوان گفت که ارزش مشتقات پتروشيمي بسيار حائز اهميت مي باشند زيرا منابع سوختي ديگري وجود دارند که از آنها به عنوان منبع انرژي مي توان استفاده نمود. حال آنکه نفت ميزاني محدود داشته و چنانچه به اتمام برسد تهيه ي مشتقات مهم آن نيز منتفي خواهد شد. لذا توليد صحيح و برنامه ريزي هاي دقيق در صنعت نقش بسيار مهمي را ايفا مي کنند و با مرور زمان بصورت رکن اساسي اين صنعت تلقي مي گردند. يکي از مهمترين نيازهاي بشر انرژي حاصل از سوخت هاي فسيلي مي باشد و حدود 85 درصد انرژي از اين طريق تامين مي شود. غالبا انرژي حاصل از سوخت هاي فسيلي طي احتراق آنها آزاد شده و مورد استفاده قرار مي گيرد.( 13) در حين اين احتراق محصولاتي زايد ايجاد ميشود که منجر به آلودگي اتمسفر و مشکلات زيست محيطي جبران ناپذيري مي گردد. همانطور که در جدول 1_1 اشاره شده است از ميان منابع مختلف انرژي بيشترين ميزان انرژي مورد نياز بشر از دو منبع نفت و زغال سنگ تامين مي شود. آلودگي هيدروکربني در بافت گياهي و جانوري ممکن است موجب مرگ يا موتاسيون گردد. امروزه يکي از مشکلات بزرگ زيست محيطي ، آلودگي هيدروکربني است. به علت استخراج نفت خام اين ترکيب يک آلوده کننده ي اصلي آب و خاک در کشورهاي توليد کننده ي نفت است. ايران اولين کشور غني از نفت در خاورميانه است که ظرفيت توليد روزانه بيش از 4 ميليون بشکه نفت خام و m3 80000 سوخت ديزلي را دارد و بيش از m3 15000000 از خاک هاي ايران با نفت خام آلوده هستند ( 18 و 20 ) .

(نمودار 1-1)قيمت هاي نفت خام به صورت واقعي و صوري

1-5 فرضيه‏هاي تحقيق
نفت خام ايران با تنوع ميکروبي بالا با احتمال زياد حاوي تنوعي از باکتري هاي بي هوازي از جمله باکتري هاي بي هوازي احياء کننده ي نيترات مي باشد. اين باکتري ها با حذف نيترات مي توانند اين باکتري ها با حذف نيترات مي توانند پلي سيکليک آروماتيک هاي با وزن مولکولي بالا را شکسته و يا حتي با شکستن آلکان هاي بلند زنجيره ، ترکيبات قابل دسترس تري براي ميکروب هاي نفتي فراهم آورند. لذا در فرآيندهاي حذف آلاينده هاي نفتي و يا سبکسازي نفت مي توانند مثمرثمر باشند. کنترل دمايي محيط به عنوان يکي از فاکتورهاي مهم در رشد و فعاليت باکتري هاي نفت زي مي تواند در ميزان حذف آلاينده ها تاثير بگذارد. محققين رشته هاي مختلف علوم خاک ، محيط زيست و رفع آلودگي هاي محيطي ، پزوهشگاهها و پالايشگاههاي نفت از اين اطلاعات در چنين فرآيندهاي مشابهي استفاده مي کنند.
1-6 سوالات تحقيق
1-آيا در نفت ايران باکتري احياء کننده ي نيترات وجود دارد؟
2-آيا نفت هاي خام مورد بررسي در اين تحقيق داراي باکتري احياء کننده ي نيترات ميباشد؟
3-چالش ها و مشکلات کشت بي هوازي ميکروبي چيست؟
4-آيا باکتري هاي احتمالي احياء کننده ي نيترات جدا شده از نفت هاي مورد بررسي قابليت ايجاد تغيير در ساختار نفت را دارند؟
5-مراحل شناسايي باکتري هاي جدا شده چگونه است؟
فصل دوم
پيشينه پژوهش

2-1 مقدمه
امروزه نفت يکي از مسائل اساسي دنياست. مسائلي از قبيل عرضه و تقاضاي نفت ، بهاي نفت ، مواد جايگزين نفت ، باکتري هاي توليد کننده ، نحوه ي بهره برداري و غيره. نمونه هاي فراهم شده از يک بستر نفتي فعاليت قابل توجهي از باکتري مزوفيليک احيا کننده ي نيترات و سولفات را نشان داده است. بانک ميکروبي بيوتکنولوژي نفت براي اولين بار در دنيا با 150 سويه ي ميکروبي توسط محققان کشورمان در پژوهشگاه صنعت نفت ايجاد شد. ايزوله کردن و توصيف صفات اختصاصي نمونه هاي جديد باکتري هاي احياء کننده نيترات از نفت از مسائل مهم اين تحقيق بشمار ميرود. نفت به عنوان يک کالاي تجاري با استراتژي هاي ملي و قدرت جهاني عجين شده است. نفت در طبقه بندي منابع خام در رديف منابع معدني استراتژيک است. نفت ايران سهم عظيمي در تجارت جهاني دارد بطوريکه در سال هاي اخير سهم کشورمان در تجارت جهاني حدود 34 % بوده است ( 20 ) .
شهرستان هاي مسجد سليمان و گچساران قسمت اعظم نفت و گاز ايران را توليد مي کنند و دو مخزن بزرگ بي بي حکيمه و گچساران که در منطقه ي گچساران واقع است هر کدام چيزي حدود 32 ميليارد بشکه نفت با کيفيت دارند و تقريبا از دهه ي هفتاد اين ميادين وارد چرخه ي توليد نفت ايران شدند. با اين حال استخراج نفت داراي مشکلاتي است و نياز به تشخيص صلاحيت قابل اعمال دارد به اين معنا که آيا محدوده ي اکتشافي استخراجي در حيطه ي صلاحيت ملي است يا صلاحيت مرجع بين المللي (سازمان ملل متحد) . در برداشت اوليه استخراج نفت بيشتر با استفاده از انرژي داخلي مخزن که توسط گازهاي تحت فشار يا رانش طبيعي توسط آب ايجاد ميشود صورت ميگيرد. در برداشت ثانويه بيشتر از تزريق آب يا آبروبي استفاده ميشود و EOR به عنوان سومين مرحله برداشت مطرح مي شود. EOR مبحثي راجع به روشهاي مورد استفاده براي بازيافت بيشتر نفت از مخازن نفتي است ( 14 و 18 ) .
ازدياد بازيافت نفت ( Improved oil) و بازيافت پيشرفته ي نفت AOR (Recovery advanced oil) معاني مشابهي با EOR دارند بجز آنکه آنها روشهاي مقدماتي و ثانويه برداشت را هم در بر ميگيرند. چهار گروه از روشهاي بازيافت حرارتي (Thermal Recovery) امتزاج گاز (Miscible gas) رانش شيميايي (Chemical recovery) و رانش ميکروبي (Flooding Microbial) وجود دارند. روشهاي ميکروبي عبارتند از : رانش ميکروبي و بازيافت ميکروبي دوره اي (Cyclic Microbial Recovery) . گاهي از امواج الکترو مغناطيس هم استفاده ميشود (EMH) که در آن با ايجاد يک ميدان مغناطيسي متغير با فرکانس بالا انرژي مولکولها افزايش يافته و در نهايت از گرماي توليد شده براي ازدياد برداشت نفت استفاده مي شود. ( از چند مگا هرتز تا 300 مگا هرتز ) از اين روش براي برداشت نفت هاي نيمه سنگين و سنگين استفاده ميشود. شدت جريان به جنس مخزن بستگي دارد.
توليد نفت سنگين کانادا در آينده ي نزديک از مرز 2/1 ميليون بشکه در روز هم مي گذرد ولي در ايران با وجود ذخاير قابل ملاحظه ي نفت سنگين به دليل عدم انتقال تکنولوژي مربوطه توليد از ميادين نفت سنگين صورت نمي گيرد. يکي از روش هاي غير حرارتي جهت ازدياد برداشت از مخازن نفت سنگين روش تزريق گاز دي اکسيدکربن است. شناسايي و ارزيابي انواع آلاينده ها در محيط راهکار مناسبي براي حل مشکلات زيست محيطي صنعت نفت ميباشد. از جمله اولويت هاي اين بخش شامل:
-پايش و شبيه سازي پراکنش آلاينده ها در محيط زيست
-کنترل و پاکسازي آلاينده ها در مناطق صنعتي
-ارزيابي و جايگزيني مواد مصرفي و توليدي در صنعت نفت در راستاي کاهش پيامدهاي زيست محيطي
-حذف نيترات از نفت خام و اثر آن روي صنايع مربوطه
-تحقيق در زمينه ي رديابي آلودگي هاي نفتي و منشا يابي آن ها
امروزه با مصرف بسيار زياد نفت سبک بسياري از کشورها رو به تکنولوژي هايي جهت قابل مصرف کردن نفتهاي سنگين نموده اند. يکي از متداول ترين روشهايي که امروزه مورد تحقيق و بررسي در جوامع علمي است استفاده از روش هاي ميکروبي است. در اين ميان شکستن ترکيبات سنگين بسيار مورد توجه هستند، يعني باکتريهايي که از نفت به عنوان منابع کربن ، ازت و گوگرد استفاده مي کنند با بيرون کشيدن اين ترکيبات از ساختارهاي پيچيده ي نفتي مثل آسفالتين يا رزين باعث فروپاشيده شدن اين ساختارها و سبک تر شدن نفت مي گردند لذا تحقيق در زمينه ي يافتن باکتري هاي بومي که قادر به انجام اين مهم مي باشند در عرصه ي بيوتکنولوزي نفت امروزه نقش به سزايي ايفا مي کند ( 16 ) .
2-2 نظريه منشاء آلي نفت
نظريه ي منشاء آلي نفت در سال 1888 توسط انگلر (Engler) و(Hofer) هوفر بيان شد. امروزه مي توان گفت که نظريه ي منشا آلي براي نفت خام نسبت به هر نظريه ديگري قابل قبول تر است. نفت خام معمولا در لايهاي رسوبي يافت مي شود و همواره مقدار زيادي مواد آلي در اين لايه ها وجود دارند. بقاياي اين مواد اعم از گياهي و يا حيواني محتوي مقدار زيادي کربن و هيدروژن هستند که سازنده ي اصلي نفت خام ميباشند. بنظر مي رسد موجودات بسيار کوچک و بي شماري که در درياها ، درياچه ها و مرداب ها زندگي مي کنند و پلانکتون ناميده مي شوند منشاء مواد آلي مولد نفت باشند. توزيع پلانکتون ها در سطح درياها يکنواخت نيست. اين موجودات در قسمت بالاي آب درياها ( عمق 50 تا 10 متري) که اشعه ي خورشيد نفوذ مي کند و نيز در مجاورت سواحل متمرکز اند. توليد مثل اين موجودات بسيار زياد است و پس از نابودي در کف درياها رسوب کرده قسمت اعظم مواد آلي را تشکيل مي دهند که بعدا با رسوب هاي مختلف مخلوط مي شوند. همچنين آب رودخانه هايي که به دريا مي ريزند حاوي مقداري مواد هيوميک است که ترکيباتشان نزديک به هيدروکربن ها ميباشد. از ديدگاه ديگر بر اساس زمان و هنگام بروز نشت نفت را به انواع زير طبقه بندي مي کنند :
1-نفت سبک و فرار :
داراي ويژگي هاي سياليت زياد و بي رنگ، سرعت پخش روي آب سريع، بوي تند و قوي و سرعت تبخير زياد مي باشد.
2- نفت نچسب :
اين نفت داراي پايه ي پارافيني متوسط تا سنگين با داشتن حالت واکسي و نچسبي مي باشد و در حرارت هاي پايين بصورت جامد در مي آيد.
3- نفت سنگين و چسبناک :
غليظ و رسوبي ، چسبناک ، معمولا بي رنگ ولي قهوه اي يا سياه نيز مي باشد و در بستر دريا ته نشين مي شود و در معرض هوا بصورت قير يا آسفالت در مي آيد.
4- نفت جامد :
حالت رسوبي و شبيه نفت سنگين و در حالت جامد خاصيت سمي ندارد و در حضور حرارت و گرما ذوب ميشود و در مجاورت آب به صورت يک لايه جامد در مي آيد.
علاوه بر اثرات ذکر شده اين مواد اثرات سوء اقتصادي بر انسان داشته و بديهي است که تهديد محيط زندگي موجودات اکوسيستم ها تاثير مستقيم بر ميزان رشد اين موجودات داشته و از جمعيت آنها مي کاهد و ناخودآگاه انسان ها نيز از آن متاثر ميشوند ( 19 ) .
2-3 ميکروبيولوژي نفت
در خصوص ميکروبيولوژي نفت ميتوان به تحقيقات Zobell اشاره کرد، وي اولين فردي بود که به شناخت و شناسايي تاثير ميکروارگانيسم ها در اکولوژي (بوم شناختي) وضعيت نفت و محيط زيست پرداخت. وي سهم منحصر به فردي در صنعت نفت دارا ميباشد. اغلب مقالات منتشر شده از وي در طي سالهاي 1940و 1950 درباره ي نقش کليدي ميکروارگانيسم ها در طرز تشکيل محصولات و فراورده هاي هيدروکربن ها بحث ميکند. وي به تهيه ي نفت خام به عنوان يک اندوخته ي تقريبا پايدار براي بهبود اين صنعت فکر ميکرد و نيز به بهبود بازيافت نفت و استفاده از فراورده هاي باکتريايي مثل اسيدها وگازها براي کمک به پويايي و تحرک فراورده هاي نفتي و بررسي مشکلات بديهي و اجتناب ناپذير آلودگي هاي نفتي و پتانسيل لازم براي استفاده از باکتري ها به عنوان عوامل کنترل کننده از جمله بررسي هاي وي بشمار ميرود. شايد اگر شناخت گسترده تري از کارها و تحقيقات Zobell وجود داشت در ميان دهه هاي اين قرن واسطه هاي ميکروبي بيشتري بازيافت نفت را بهبود مي بخشيدند .
در ارتباط با ميکروبيولوژي در صنعت نفت ميتوان دو جنبه را مد نظر قرار داد :
1-ارتقاي کمي که نمونه ي بارز آن MEOR ( Microbial Enhanced Oil Recovery )
2-ارتقاي کيفي (مانند حذف هسته و اتم هاي گوگرد و نيتروژن)
در طبيعت چاه هاي نفتي وجود دارند که به علت تزريق آب ديگر قادر به توليد نفت نيستند و نيز چاههايي وجود دارند که به دليل رسوب ترکيبات آلي و معدني مسدود شده اند ، لذا بعد از استخراج اوليه و ثانويه نفت قسمت اعظم آن ( حدود 80 % ) در چاه ها باقي مي ماند. به همين منظور روشهاي مختلفي براي استخراج مابقي نفت بوجود آمده است که عبارتند از : تزريق آلياژهاي پليمري ، روش حرارتي ، تزريق آب ، تزريق گاز ، استفاده از مواد شيميايي کاهش دهنده ي نيروي کشش سطحي .
روش MEOR روشي است که در آن بوسيله ي ميکروبهاي مخصوص و مشخص ميزان نفت استخراجي از چاه ها را افزايش مي دهند . ميکروبها به سه طريق ميتوانند باعث ازدياد برداشت از مخازن نفتي شوند :
* با اکسيداسيون نفت اسيد چربي توليد ميکنند که باعث کاهش گرانروي نفت مي گردد
* با توليد مقادير نسبي از گاز CO2 باعث افزايش فشار در مخزن شده از اينرو مانند تزريق گاز عمل ميکنند
* ميکروبها با بوجود آوردن Bio mass ميان سنگ و نفت مخزن باعث جابجايي فيزيکي نفت ميشوند
شرايط فيزيکي نفت مثل دما ، فشار ، نمک و… عامل محدود کننده ي استفاده از MEOR است. در چاه هاي عميق مثل کشور ما بايد از ميکروارگانيسم هاي گرمادوست استفاده شود. خصوصيات ميکروبها يا باکتري هاي مورد استفاده : کوچک باشد- قادر به تحمل شرايط محيطي چاه باشد- رشد سريعي داشته باشد و داراي تحرک لازم و کافي داخل چاه باشد- بتواند مواد ضد ميکروبي و ضد خوردگي را تحمل کند- براي رشد به مواد مغذي پيچيده نياز نداشته باشد. انواع باکتري هاي مورد استفاده شامل : سودوموناس ، ميکروکوکوس ، کلستريديوم ، انتروباکترياسه ، اشرشياکلي ، مايکوباکتريوم ، لوکونوستوک ، باسيلوس لينکني فرميس .
حدود 25 % از نفت خام رها شده در آب از طريق تبخير از بين مي رود و بقيه توسط اکسايش نوري و اکسايش ميکروارگانيسم ها شکسته مي شود که به Bioremediation معروف است. ميکروارگانيسم هايي مثل باکتري ها و قارچ ها ( اکتينوميست ها) در اين عمل نقش دارند ولي در اين ميان سودوموناس ها اهميت بيشتري دارند. بطور کلي ميکروارگانيسم ها به کمک سه فراورده قادر به تجزيه ي هيدروکربن هاي نفتي مي باشند: آنزيم ها – بيوسورفاکتانت- اسيدها و حلال ها ( 1 و 4 ) .
محققان کانادايي 4 پلاسميد PkT230 , PPK2033 , PHG2 , PAC25 را در سودوموناس پوتيدا قرار داده و سويه اي توليد کرده اند که قادر است همزمان نفتالين، پارافين، بنزن و آسفالتين را تجزيه کند و در واقع باعث افزايش ارتقاء کيفي نفت مي گردد.
2-3-1 ارتقاء کيفي
روش هاي نوين در ارتقا كيفيت نفت خام و تبديل اجزاي سنگين نفت به اجزاي سبك تر مانند پرتو افكني الكتروني، اشعه گاما و اشعه ايكس؛ امروزه نسبت به روش هاي قديمي تر نظير كراكينگ گرمايي و كاتاليستي مورد توجه بيشتري قرار گرفته اند. كارهاي تحقيقاتي كه در اين زمينه صورت گرفته است، مزاياي استفاده از اين روش هاي نوين را تاييد مي نمايند. كاهش تدريجي كيفيت نفت خام و قوانين محدود كننده پروتكل كيوتو مسائلي هستند كه امروزه پالايشگاههاي سراسر جهان با آن مواجهند. اين مشكلات همراه با كاهش تقاضاي بازار جهاني براي نفت كوره سنگين پالايشگاهي و همچنين رشد تقاضا براي سوختهاي سبك تر و پاك تر افزايش مي يابند. از سال 1975 تا سال 2000 سهم بازار جهاني نفت كوره از 30 % تقاضا براي محصولات پالايشگاهي به حدودا 15
% رسيده است. انتظار ميرود اين روند در طول 20 سال آينده به طور پيوسته ادامه يابد و تا سال 2020 تا 10?
ديگر هم كاهش يابد. عوامل فوق پالايشگاههاي سراسر جهان را بر آن داشته است تا به دنبالراهكارهائي براي استفاده از تركيبات سنگين پالايشگاهي به جاي افزايش دادن پروسس نفت خام باشند.
يكي از بهترين روشهاي ارتقاء كيفيت تركيبات سنگين نفتي كه بدليل قابليتهاي بالاي آن در رفع مشكلات و بر آورده سازي نيازهاي موجود در پالايشگاهها طي سالهاي اخير بسيار مورد توجه قرار گرفته است روش Gasification مي باشد. چراكه استفاده از اين روش ما را قادر مي سازد علاوه بر خارج ساختن مقادير زيادي CO امكان كاهش تركيبات سنگين و كم ارزش از بازارهاي داخلي و خارجي، ميزان توليد در يك سيستم جذب آميني نسبتا ساده را نيز داشته باشيم قابليت استفاده ار اين روش براي سوختهاي با محتواي سولفور بسيار بالا و همچنين توانايي آن در كاهش دادن ميزان انتشارات گلخانه اي، برتري اين روش نسبت به ساير روشهاي ارتقاء كيفيت را به خوبي نشان مي دهد. به فر آيند توليد گازي كه داراي درصد بالايي هيدروژن و مونوكسيد كربن ميباشد از طريق احتراق ناقص سوختها Gasification گفته مي شود. تعداد بسيار زيادي از انواع هيدروكربنها ميتوانند به عنوان خوراك در اين فرآيند مورد استفاده قرار گيرند كه عموما محصولات جانبي كم ارزش و يا ضايعات مربوط به ساير فرايند ها و تركيبات سنگين نفتي مانند ته مانده برج خلاء ,ته



قیمت: تومان


پاسخ دهید