واحد رشت
دانشکده کشاورزي _ گروه باغباني
پايان نامه جهت اخذ مدرک کارشناسي ارشد (M.Sc)
عنوان تحقيق
اثر غلظت هاي مختلف 2،4-D و BAP و انواع محيط کشت (جامد، مايع و دولايه) بر ريز ازديادي ليسيانتوس (Eustoma grandiflorum)
استاد راهنما
دکتر عليرضا ترنگ
استاد مشاور
دکتر بهزاد کاوياني
نگارش
بهناز بهاري
92
?

Islamic Azad University
Rasht Branch
Agriculture Sience, Department of Horticulture Faculty of
M.Sc Thesis
Subject
The effect of different concentrations of 2،4-D and BAP and
various culture media (solid، liquid – two-phases) on micropropagation of Lysyantus (Eustoma grandiflorum)
Advisor
Ali Reza Tarang
Superrisor
Behzad Kaviani
By
Behnaz Bahari
2013
سپاسگزاري
اکنون که با استعانت از درگاه باريتعالي و در ظل توجهات حق و مساعدت اساتيد معظم، موفق به انجام پروژه پژوهشي خود شدم، بر خود لازم ميدانم از تمام اساتيد و بزرگواراني که مرا ياري دادند، صميمانه تقدير و تشکر نمايم. مراتب سپاس خود را به همسر عزيز و خانواده مهربانم به پاس لطف و محبتهاي بيدريغشان نثار مينمايم. از رهنمودهاي ارزنده اساتيد ارجمندم جناب آقايان دکتر عليرضا ترنگ و دکتر بهزاد کاوياني که با سعه صدر و درايت خاص در به پايان رساندن اين مهم مرا ياري نمودند، تشکر و قدرداني ميکنم. از اعضاي محترم هيئت علمي گروه باغباني دانشگاه آزاد رشت آقايان دکتر شهرام صداقت حور، دکتر داود هاشم آبادي، دکترعلي محمدي ترکاشوند و دکتررسول انسي نژاد که همواره افتخار شاگردي ايشان را خواهم داشت، سپاسگزارم. از سرکار خانم مهندس بهلولي و اقاي مهندس شيخ پور و مهندس صياد و کارکنان محترم آزمايشگاه مؤسسه بيوتکنولوژي شمال کشور در فراهم نمودن امکانات اجرايي اين پژوهش کمال امتنان را دارم. براي تمامي عزيزان و دوستاني که در اين دوره افتخار مصاحبت با آنها را داشتهام آرزوي موفقيت و بهروزي دارم.
تقديم به
همسر عزيزم، که هميشه يار و ياورم بوده وصبورانه وصميمانه مرا در اين راه ياري نمود.
وپدر بزرگوارم، که هستيام از شمع وجود ايشان روشني گرفته است.
ومادر صبورم، که بزرگترين مشوق من در امر مقدس تحصيل بود.
وخواهر مهربانم و برادران عزيزم، به پاس زحمات و محبتهاي بيدريغشان.
وهمه پويندگان راه علم و حقيقت.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکيده فارسي…………………………………………………………………………………………………………………………………………1
فصل اول: مقدمه
1-1- مقدمه……..3
فصل دوم: بررسي منابع
2-1- گياه شناسي……. 6
2-1-1- تاريخچه و پراکنش……. 6
2-1-2- ريخت شناسي……. 8
2-1-3- ارقام مختلف ليسيانتوس……….9
2-2- اهميت ريزازديادي در صنايع دارويي و زينتي……..9
2-2-1- تاريخچه ريزازديادي ليسيانتوس……..9
2-2-2- اهميت ريزازديادي ليسيانتوس……10
2-2-3- روشهاي ريزازديادي ليسيانتوس……12
2-3- نقش تنظيم کنندههاي رشد گياهي……12
2-3-1- تاثير تنظيم کنندههاي رشد گياهي در ريزازديادي ليسيانتوس……13
2-4- اثر نوع ريزنمونه……14
2-4-1- ريزنمونه ساقه……14
2-4-2- ريزنمونه برگ……14
2-4-3- ريزنمونه پروتوپلاست……16
2-4-4- ريزنمونه ميانگره……17
2-4-5- ريزنمونه نوک شاخساره……17
2-4-6- ريزنمونه جوانه نابجا……17
2-4-7- ريزنمونه جوانه جانبي و انتهايي……18
2-4-8- ريزنمونه ريشه……18
2-5- اثر نوع رقم……19
2-6- اثر تنظيم کنندههاي رشد گياهي بر ساير گياهان………………………………………………………………………..21
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- مواد گياهي……23
3-2- انتقال نمونهها از شرايط برون شيشهاي به شرايط درون شيشهاي……23
3-2-1- گندزدايي ريزنمونهها……23
3-2-2- محيط کشت (در محيط جامد، مايع و دولايه)……24
3-2-3- کشت ريزنمونهها……24
3-3- نگهداري ريزنمونهها……25
3-4- باززايي و ايجاد گياهچه از ريزنمونههاي کشت شده……25
3-5- سازگاري گياهچهها با محيط طبيعي……26
3-6- تجزيه و تحليل آماري……26
فصل چهارم: نتايج
4-1- ضدعفوني ريزنمونه……28
4-1-1- تشخيص نوع آلودگي……28
4-2- اثر تيمارهاي مختلف بر صفات اندازهگيري شده در محيط جامد……28
4-2-1- اثر متقابل غلظتهاي مختلف 2,4-D و BAPبر صفات اندازهگيري شده در محيط جامد……35
4-2-1-1- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر طول شاخساره……35
4-2-1-2- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر تعداد شاخساره……37
4-2-1-3- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر تعداد گره……37
4-2-1-4- اثر متقابل 2,4-D و BAPبرطول ميانگره……37
4-2-1-5- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر طول تکثير…………………………………………………………….38
4-2-1-6- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر تعداد ريشه……38
4-2-1-7- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر طول ريشه……38
4-2-1-8- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر وزن تر……39
4-2-1-9-اثر متقابل 2,4-D و BAPبر وزن خشک……39
4-2-1-10- اثر متقابل 2,4-D و BAPبرسبزينگي……39
4-2-1-11- اثر متقابل 2,4-D و BAPبرکالوس زايي……39
4-2-2- اثر تيمارهاي مختلف بر صفات اندازهگيري شده در محيط دولايه……44
4-2-3- اثر تيمارهاي مختلف بر صفات اندازهگيري شده در محيط مايع……50
4-2-4- نتايج صفات کمي مشاهده شده در مرحله استقرار ريزنمونه……54
4-2-5- الگوي رشد……54
4-2-6- سازگاري……54
فصل پنجم: بحث و نتيجهگيري
بحث……58
نتيجهگيريکلي ………………………………………………………………………………………………………………………….66
پيشنهادها……67
فهرست منابع……69
چکيده انگليسي……72
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 3-1- نمايي از نقشه اجراي طرح ريزازديادي ليسيانتوس ……25
جدول 4-1- تجزيه واريانس تيمارهاي مختلف بر صفات اندازهگيري شده گياهچه ليسيانتوس……29
جدول 4-2- مقايسه ميانگين اثرات متقابل2,4-D و BAP بر صفات اندازهگيري شده (ميانگين ±SD)………36
جدول 4-3- نتايج حاصل از کشت ريزنمونه جوانه در محيط دولايه با غلظتهاي مختلف 2,4-D و BAP…..49
جدول4-4- نتايج صفات کمي مشاهده شده در مرحله استقرار ريزنمونه جوانه ليسيانتوس………………………..55
فهرست شکلها
عنوان صفحه
شکل 2-1- ليسيانتوس گرانديفلوروم (Eustoma grandiflorum)……. 7
شکل 2-2- ليسيانتوس اگزالتاتوم (exaltatum Eustoma)…………………………………………………………… 7
شکل 4-1- اثر BAP 0+ 2,4-D 0 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد…………………30
شکل 4-2- اثر BAP 5/0+ 2,4-D 0 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد……………….30
شکل 4-3- اثر BAP 2+ 2,4-D 0 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد……30
شکل 4-4- اثر BAP 5+ 2,4-D 0 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد……31
شکل 4-5- اثر BAP 0+ 2,4-D 01/0 بر باززايي وايجادگياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد…………….. 31
شکل 4-6- اثر BAP 5/0+ 2,4-D 01/0 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيطجامد…………..31
شکل 4-7- اثر BAP 2+ 2,4-D 01/0 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد……………32
شکل 4-8- اثرBAP 5+ 2,4-D 01/0 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد……………..32
شکل 4- 9- اثر BAP 0+ 2,4-D 1/0 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد……………..32
شکل 4-10- اثر BAP 5/0+ 2,4-D 1/0 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد…………33
شکل 4-11- اثر BAP 2+ 2,4-D 1/0 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد…………….33
شکل 4-12- اثر BAP 5+ 2,4-D 1/0 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد…………….33
شکل 4-13- اثر BAP 0+ 2,4-D 1 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد……………….34
شکل 4-14- اثر BAP 5/0+ 2,4-D 1 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد……………34
شکل 4-15- اثر BAP 2+ 2,4-D 1 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد……………….34
شکل 4-16-اثر BAP 5+ 2,4-D 1 بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط جامد………………..35
شکل 4-17- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر ميانگين طول شاخساره ريزنمونه ليسيانتوس در محيط جامد……. 40
شکل 4-18- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر تعداد شاخساره ريزنمونه ليسيانتوس در محيط جامد……………….40
شکل 4-19- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر ميانگين تعداد گره ريزنمونه ليسيانتوس در محيط جامد…………..41
شکل 4-20- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر ميانگين طول ميانگره ريزنمونه ليسيانتوس در محيط جامد……….41
شکل 4-21- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر ميانگين ميزان تکثير ريزنمونه ليسيانتوس. در محيط جامد………..41
شکل 4-22- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر ميانگين تعداد ريشه ريزنمونه ليسيانتوس در محيط جامد………….42
شکل 4-23- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر ميانگين طول ريشه ريزنمونه ليسيانتوس در محيط جامد…………..42
شکل 4-24- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر ميانگين وزن تر ريزنمونه ليسيانتوس در محيط جامد……………….42
شکل 4-25- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر ميانگين وزن خشک ريزنمونه ليسيانتوس در محيط جامد………..43
شکل 4-26- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر ميانگين سبزينگي ريزنمونه ليسيانتوس در محيط جامد…………….43
شکل 4-27- اثر متقابل 2,4-D و BAPبر ميانگين وزن کالوس ريزنمونه ليسيانتوس در محيط جامد………..43
شکل 4-28- اثر BAP) 0+ 2,4-D 0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس درمحيط دولايه……………45
شکل 4-29-اثر BAP) 5/0+ 2,4-D 0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط دولايه…………45
شکل 4-30- اثر BAP) 2+ 2,4-D 0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط دولايه…………..45
شکل 4-31- اثر BAP) 5+ 2,4-D 0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط دولايه………….45
شکل 4-32-اثر BAP) 0+ 2,4-D 01/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط دولايه……..46
شکل 4- 33-اثرBAP) 5/0+ 2,4-D 01/0) بر باززايي وايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط دولايه…….46
شکل 4-34- اثر BAP) 2+ 2,4-D 01/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط دولايه……..46
شکل 4-35-اثر BAP) 5+ 2,4-D 01/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط دولايه………46
شکل 4- 36- اثر BAP) 0+ 2,4-D 1/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط دولايه……….47
شکل 4-37-اثر BAP) 5/0+ 2,4-D 1/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط دولايه……..47
شکل 4-38- اثر BAP) 2+ 2,4-D 1/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط دولايه………..47
شکل 4-39- اثر BAP) 5+ 2,4-D 1/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط دولايه………..47
شکل 4-40-اثر BAP) 0+ 2,4-D 1) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط دولايه……………48
شکل 4-41- اثر BAP) 5/0+ 2,4-D 1) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس دولايه……………………..48
شکل 4-42- اثر BAP) 2+ 2,4-D 1) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط دولايه…………..48
شکل 4-43- اثر BAP) 5+ 2,4-D 1) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط دولايه…………..48
شکل 4-44- اثر BAP) 0+ 2,4-D 0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع………………50
شکل 4-45- اثر BAP) 5/0+ 2,4-D 0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع…………..50
شکل 4-46- اثر BAP) 2+ 2,4-D 0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع………………50
شکل 4-47-اثر BAP) 5+ 2,4-D 0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع………………50
شکل 4-48- اثر BAP) 0+ 2,4-D 01/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع………..51
شکل 4- 49-اثر BAP) 5/0+ 2,4-D 01/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط.مايع……..51
شکل 4-50- اثر BAP) 2+ 2,4-D 01/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع…………51
شکل 4-51- اثر BAP) 5+ 2,4-D 01/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع…………51
4- 52- اثر BAP) 0+ 2,4-D 1/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع………………….52
شکل 4-53-اثر BAP) 5/0+ 2,4-D 1/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع…………52
شکل 4-54- اثر BAP) 2+ 2,4-D 1/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع…………..52
شکل 4-55- اثر BAP) 5+ 2,4-D 1/0) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع…………..52
شکل 4-56-اثر BAP) 0+ 2,4-D 1) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع……………….53
شکل 4-57-اثر BAP) 5/0+ 2,4-D 1) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع……………53
شکل 4-58- اثر BAP) 2+ 2,4-D 1) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع………………53
شکل 4-59- اثر BAP) 5+ 2,4-D 1) بر باززايي و ايجاد گياهچههاي ليسيانتوس در محيط مايع………………53
شکل 4-60- سازگاري گياهچههاي انتقال يافته به شرايط برون شيشهاي………………………………………………..56
چکيده
فنون کشت بافت براي ريزازديادي و توليد گياهان عاري از عوامل بيماريزا مورد استفاده قرار ميگيرد. ريزازديادي ابزار مؤثري در تکثير گياهان زينتي در مقياس وسيع است. غلظت تنظيم کنندههاي رشد گياهي از عوامل بسيار مهم ريزازديادي گياهان در شرايط درون شيشهاي است. ليسيانتوس يک گياه زينتي است که رويکرد سنتي تکثير آن با بذر ميباشد؛ اما تکثير آن در مقياس وسيع به علت وجود آلودگي اين روش، توصيه نميگردد. به منظور ريزازديادي ليسيانتوس، از جوانههاي رأسي و جانبي عاري از بيماري استفاده شد. آزمايشها در قالب طرح کاملاً تصادفي با سه تکرار روي محيطهاي کشت موراشيک و اسکوگ (MS) با غلظتهاي مختلف 2و4- دي کلرو فنوکسي استيک اسيد (2،4- D) در چهار سطح (0، 01/0، 1/0 و 1 ميليگرم در ليتر) و 6- بنزيل آمينوپورين (BAP) در چهار سطح (0، 5/0، 2 و 5 ميليگرم در ليتر) کشت شدند. در مرحله استقرار ريزنمونه، بيشترين طول شاخساره و سبزينگي از محيط کشت داراي 1/0 ميلي گرم درليتر2,4-D (فاقد BAP) حاصل شد. بيشترين تعداد شاخساره در محيط کشت داراي 1/0 ميليگرم در ليتر 2,4-D همراه با 5 ميليگرم در ليتر BAP توليد شد. بيشترين تعداد گره در محيط کشت داراي1/0 ميليگرم در ليتر 2,4-D (فاقدBAP) و 01/0 ميليگرم در ليتر 2,4-D همراه با 5/0 ميليگرم در ليتر BAPتوليد شد. بيشترين طول ميانگره در محيط کشت داراي 1/0 ميليگرم در ليتر 2,4-D همراه با 5/0 ميليگرم در ليتر BAP و 1/0 ميليگرم در ليتر 2,4-D (فاقدBAP) و 01/0 ميليگرم در ليتر 2,4-D همراه با 5/0 ميليگرم در ليتر BAP توليد شد. بيشترين ميزان تکثير و پرآوري در محيط داراي 1/0 ميليگرم در ليتر 2,4-D همراه با 5 ميليگرم در ليتر BAP و2 ميليگرم در ليتر BAP (فاقد2,4-D) حاصل شد. بيشترين تعداد، طول ريشه و وزن خشک در محيط کشت فاقد هورمون بدست آمد. بيشترين وزن تر، در محيط کشت داراي 1/0 ميليگرم در ليتر 2,4-D همراه با 5 ميليگرم در ليترBAP حاصل شد و بيشترين کالوس زايي در محيطکشت داراي 1 ميليگرم در ليتر 2,4-D همراه با 5/0 ميليگرم در ليترBAP مشاهده گرديد.
کلمات کليدي: ليسيانتوس، کشت بافت، 2و4- دي کلرو فنوکسي استيکاسيد(2،4- D) و 6- بنزيل آمينوپورين (BAP).
فصل اول
مقدمه
1-1- مقدمه
اصطلاح ريزافزايي1(ريزازديادي)، به تکثير رويشي گياهان در شرايط درون شيشهاي و گندزدايي شده با استفاده از بخشهاي کوچک گياه اطلاق ميشود (خوشخوي، 1378؛ چيري2، 2002). ريزازديادي بزرگترين پيشرفت تکنولوژي کشت بافت گياهي ميباشد که در آن انبوهي از گياهان با ساختار ژنتيکي يکسان بدست ميآيد. در ريزازديادي مقدار بسيار کمي از بافت گياه به عنوان ريزنمونه نياز ميباشد و در برخي از گونههاي گياهي که به روشهاي رايج تکثير نميشوند، ريزازديادي، روش مناسبي است و در هر فصلي از سال قابل اجرا است و تغييرات فصلي تأثيري در اجراي آن ندارد و با اين روش گياهان عاري از ويروس حاصل ميشوند (کهريزي، 1389). ريزازديادي ابزار مؤثري در تکثير گياهان زينتي در مقياس وسيع است. براي اينکه تجارت گلهاي شاخه بريده در سطح جهاني مطرح شود، فنون جديدي توسعه يافتهاند (روت و جين3، 2004). روشهاي پيشرفتهاي در اختيار توليد کنندگان گياهان زينتي و دارويي قرار دارد که ميتوانند نيازهاي بازارهاي جهاني را در قرن آينده فراهم کنند. اين دستورالعملها بر اساس سطوح بهينه قندها، ترکيبات آلي، مواد معدني، عوامل محيطي و تنظيم کنندههاي رشد گياهي بوده و مقادير بالايي از باززايي را در شرايط درون شيشهاي پديد ميآورند. فلور طبيعي گياهي ايران شامل تعداد زيادي گونههاي گياهي است، اما فرسايش ژنتيکي باعث از دست رفتن گونههاي متعددي شده است، به طوري که بسياري از گونههاي با ارزش دارويي و زينتي تحت حفاظت قرار دارند. ريزازديادي يک روش مناسب براي تکثير تجاري بوده و براي ازدياد گونههاي مختلف دارويي و زينتي مورد استفاده قرار ميگيرد.
ليسيانتوس (Eustoma grandiflorum) گياهي زينتي است که به عنوان گل شاخه بريده و گلداني مورد استفاده قرار ميگيرد (پايک و هاهن4، 2000). روش معمول تکثير آن با بذر (ساده و قرصي5) است و با توجه به اينکه بذر آن بسيار ريز است، توليد با اين روش در سطح وسيع با دگرزايويگي و احتمال آلودگي گياهچه روبرو است (فروکاوا و همکاران6، 1990). توليد نشاي ليسيانتوس در ايران توسط چند شرکت محدود که با بزرگترين توليد کننده نشاي ليسيانتوس در هلند مرتبط هستند، صورت ميگيرد و از زمان کاشت بذر (بذرهاي وارداتي) تا توليد نشا، دوازده هفته طول ميکشد. بنابراين استفاده از روش ريزازديادي، يکي از راههاي دستيابي به تعداد زيادي نشاي ليسيانتوس با ساختار ژنتيکي يکسان و کاهش هزينههاي توليد ميباشد و امکان توليد مداوم و سريع را در پي دارد (سمنيوک و گريسباخ7، 1987). بنابر اطلاعات بدست آمده در ايران، پژوهش مختصري در زمينه باززايي ليسيانتوس از طريق کشت بافت صورت پذيرفته است، ولي تاکنون گزارشي مبني بر توليد گسترده گياهچههاي ليسيانتوس از طريق ريزازديادي منتشر نشده است.
هدف از پژوهش حاضر، بررسي اثر غلظت هاي مختلف D-4،2 و BAP و انواع محيط کشت (جامد، مايع و دولايه) بر ريز ازديادي گياه ليسيانتوس به منظور دستيابي به بهترين غلظت و محيط کشت است.
فصل دوم
بررسي منابع
2-1- گياه شناسي
2-1-1- تاريخچه و پراکنش
ليسيانتوس از خانواده جنتياناسه8 است. جنس ليسيانتوس بومي ايالات متحده جنوبي، نبراسکا، لويزيانا و مکزيک است و با نامهاي انگليسي تگزاس بلوبل9، توليپ جنتين10 و پرياري جنتين11 شناخته شده است و سه گونه از اين جنس معرفي شده است:
1-Eustoma grandiflorum Syn. E. russelianum Shinners ، از اهميت تجاري زيادي برخوردار است. اين گياه زينتي که داراي ارزش اقتصادي بالايي است، بيش از 50 سال قبل در ژاپن معرفي شد. بيش از 15 واريته از آن شناخته شده است و براي توليد گياه گلداني گلدار و گل شاخه بريده، پرورش داده ميشود (شکل 2-1).2- Eustoma exaltatum L. Salisb (شکل 2-2). 3-Eustoma barkleyi Standley (اوبرين و ليندساي12، 1993؛ آرميتاژ و لائوشمن13، 1993؛ اسکرزيپکزاک14 و همکاران، 1993؛ زاکاي و ادري15، 2002).
شکل 2-1- ليسيانتوس گرانديفلوروم) Eustoma grandiflorum)
شکل 2-2- ليسيانتوس اگزالتاتوم ( exaltatum Eustoma)
ژوسيو16 (1789) خانواده جنتياناسه را کشف کرد. در خانواده جنتياناسه، تاکنون 87 جنس و حدود 1600 گونه شناخته شده است (استرو و آلبرت17، 2002).
2-1-2- ريخت شناسي
گونه (Eustoma grandiflorum) گياه علفي، يکساله يا دو ساله (گيلمن18، 1999) يا چند ساله (دال و همکاران19، 2000) داراي ريشههاي ضخيم و برگهاي تخم مرغي، سبز مايل به آبي، متقابل، بدون کرک با حاشيه صاف و ساقههاي سبز مايل به زرد و گلهايي به رنگهاي متنوع آبي، سفيد، صورتي، زرد، نباتي، قرمز، بنفش، ارغواني و ترکيبي از رنگهاست (اوبرين و ليندساي، 1993؛ آرميتاژ و لائوشمن، 1993؛ لنگهام20، 1995؛ گيلمن، 1999). ليسيانتوس گياهي است با گل آذين گرزن تک سويه21 و ساقههاي انتهايي بعد از ظهور برگهاي حقيقي ظاهر ميشوند. ساقه اصلي توليد گل انتهايي ميکند در حالي که گلهاي ديگر همچنان بر ساقه به شکل خوشه توسعه يافتهاند. کاسبرگها کوچکتر از گلبرگها هستند و پرچمها دراز و بساکها کمي پيچ خوردهاند. طول عمر گل، 14-7 روز است. گل بالغ داراي 5 کاسبرگ، 5 گلبرگ و 5 پرچم و يک تخمدان تک حجرهاي با دو کلاله (اسکيس22، 2001؛ زاکاي و ادري، 2002) و ميوه نامعلوم است (گيلمن، 1999).
2-1-3- ارقام مختلف ليسيانتوس
گلهاي ليسيانتوس بسيار زيبا و بيبو هستند (آرانويچ و همکاران23، 2007) و به آساني با گل رز اشتباه گرفته ميشوند (دال و همکاران، 2000). ارقام گونه گرانديفلوروم با گلهاي منفرد24 و مضاعف25 (اوبرين و ليندساي، 1993) به طور کلي به سه گروه زمستانه، بهاره و تابستانه تقسيم ميشوند (آرميتاژ و لائوشمن، 1993).
2-2- اهميت ريزازديادي در صنايع دارويي و زينتي
در سالهاي اخير تمايل به استفاده از گياهان دارويي و ترکيبات حاصل از آنها در حال افزايش است. در حال حاضر بيش از 40 درصد از داروهاي مصرف شده در کشورهاي پيشرفته غربي داراي منشاء گياهي ميباشند (موران و همکاران26، 2003). گرايش به استفاده از گياهان دارويي براي توليد دارو در اکثر کشورها در حال افزايش است و کشور ما نيز از اين قاعده مستثني نيست. تکثير اکثر گياهان دارويي با استفاده از روشهاي مرسوم امکان پذير نميباشد و روشهاي ديگري همچون تکثير غيرجنسي براي تکثير گياهان زينتي ابداع شده است. ريزازديادي يک روش کارآمد و مفيد جهت توليد اين گونه گياهان مي باشد و امروزه شاهد استفاده وسيع و گسترده از اين روشها در جهت توليد گياهان دارويي ميباشيم (روت و همکاران، 2000).
2-2-1- تاريخچه ريزازديادي ليسيانتوس
ارزش تجاري گياهان زينتي به روشهاي خوب تکثير است (روت و جين، 2004). ليسيانتوس به عنوان گل شاخه بريدني بسيار مورد توجه قرار دارد. اين گياه به صورت گلداني هم مورد استفاده قرار مي گيرد (اوبرين و ليندساي، 1993). مطالعات و پژوهشهاي گستردهاي در زمينه ريزازديادي اين گياه صورت گرفتهاست که نتايج آنها در قالب مقالات و گزارشهاي علمي انتشار يافته است. در طي چند دهه اخير، پژوهشگران و دانشمندان بزرگ و صاحب نامي همچون يونگ هوي27 ، کيون28، اردوق29، کي دونگ30، مينگگزيا31، و ديگران آزمايشات متنوع و گستردهاي در زمينه ريزازديادي ليسيانتوس انجام دادهاند که در بخشهاي بعد به نتايج پژوهشهاي آنان اشاره خواهد شد.
2-2-2- اهميت ريزازديادي ليسيانتوس
شهرت ليسيانتوس در بازار گياهان زينتي در جهان افزايش يافته است (هامو و همکاران32، 2010) و محصول نسبتاً جديدي است که در بازارهاي بينالمللي به دليل شباهت به گل رز به سرعت در بين ده گل اول جهان قرار گرفته است (پوپسکو و همکاران33،2007).
ايران با دارا بودن شرايط متغير اقليمي، صاحب تنوع غني از گياهان مختلف ميباشد. اگر ارزآوري گلهاي شاخه بريده با نفت مقايسه شود، مشاهده ميشود که فروش چند شاخه گل بريده، ارزآوري معادل يک بشکه نفت دارد و صادرات گل و گياهان زينتي ميتواند جانشين صادرات نفت شود. ارزآوري گل و گياه براي ايران يک موقعيت انحصاري بوده و در حدي است که لزوم استفاده از روشهاي نوين توليد، همچون ريزازديادي را با توجه به فراهم نمودن امکان توليد تجاري و صادراتي اين گياه ايجاب ميکند.
ليسيانتوس جزء معدود گياهاني است که در برابر گرما مقاوم ميباشد و در تابستان عليرغم گرما، رشد بسيار خوبي دارد و دماي مناسب رشد در شب 18-15 سانتيگراد ودر روز 24-21 درجه سانتيگراد ميباشد. فصل رويش ليسيانتوس تير تا مهر ماه ميباشد. گونههاي جنس ليسيانتوس از گياهان بسيار زيبا و بسيار جذابي ميباشند. ارقام مختلف اين گياه داراي گلهاي بسيار زيبا و رنگارنگ هستند.
روش متداول تکثير ليسيانتوس از طريق بذر است. بذرها ريزند و براي کشت دستي به سختي در مشت دست جاي ميگيرند. با بذرپاشي در سينيهاي کشت چند خانهاي، 288 تا 392 نشا پس از 12 هفته به دست ميآيد (دال و همکاران، 2000). سرمادهي بذر در دماي 35 درجه فارنهايت (2 درجه سانتيگراد) در مدت 15-11 روز در جوانه زدن نقش دارد اما جوانهزني اغلب بذرها با مشکل مواجه است (آرميتاژو لائوشمن، 1993؛ ايکر و همکاران34، 1994). در برخي ارقام خصوصاً آنهايي که رنگبندي متفاوتي دارند، به علت دگرزايوگي2 گياهان حاصل شبيه به گياهان مادري نيستند (فوروکاوا و همکاران، 1990). روش ديگر، جداسازي قلمههاي انتهاي ريشه از دانهال است که در زير مهافشان در مدت دو هفته در 75 درجه فارنهايت ( 24 درجه سانتيگراد) به مدت 2 هفته نگهداري ميشوند. براي توليد بيشترين قلمه، دانهالها بايد در تيمار نوري بيش از 12 ساعت روشنايي باقي بمانند، البته اين روش توصيه نميگردد، مگر آنکه گياهان مادري در دسترس باشند (آرميتاژو لائوشمن، 1993) زيرا سرعت تکثير خيلي کند است و تعداد کمي قلمه از گياه مادري به دست ميآيد (پايک و هاهن، 2000).
استفاده از روش ريزازديادي در ليسيانتوس يکي از راههاي دستيابي به تعداد زيادي گياه با ساختار ژنتيکي يکسان است که کاهش هزينههاي توليد، امکان توليد مداوم و سريع را در پي دارد. افزايش کلونيهاي انتخاب شده رويشي استريل در محيط کشت، در مورد ليسيانتوس بايد مهم تلقي گردد تا در مقياس وسيع صفات مطلوبي مانند توليد بالا، کوتولگي، مقاومت به بيماري با سرعت بيشتري گسترش يابد (سمنيوک وگريسباخ، 1987).
2-2-3- روشهاي ريزازديادي ليسيانتوس
در ريزازديادي ليسيانتوس با توجه به اهداف و مقاصدي که مورد نظر بوده است، ريزنمونههاي ذيل مورد استفاده قرار گرفته اند: پروتوپلاست (اوبرين و ليندساي ، 1993؛ کونيتاک و همکاران، 1995)، نوک شاخساره (سمنيوک و گريسباخ، 1987؛ پايک و هاهن، 2000)، ميانگره (باللال،1990)، جوانه جانبي و جوانه نابجا (موسوي و همکاران، 1389؛ اسکرزيپکزاک، 1993)، برگ (مينگ گزيا و همکاران، 2008؛ کيون و همکاران، 2008؛ باروت سيد و تيکسيرا35، 2006؛ سمنيوک و گريسباخ، 1987؛ فوکاي و همکاران، 1996؛ ژوهوآ و همکاران، 2009؛ روفوني و همکاران، 1990)، ريشه (فروکاوا و همکاران، 1990؛ فوکاي و همکاران36، 1991) و ساقه (يونگ هوي و همکاران، 2008؛ کي دونگ و همکاران، 2003). در بين ريزنمونههاي فوق، ريزنمونه برگ نتايج بهتر و مطلوبتري داشته است.
2-3- نقش تنظيم کنندههاي رشد گياهي
در کشت درون شيشهاي گياهان، نقش تنظيم کنندههاي رشد خصوصاً اکسين و سيتوکينين بارز است. اکسينها معمولاً باعث تقسيم سلولي، رشد طولي سلول، تورم بافتها، ايجاد پينه، تشکيل ريشه نابجا، ممانعت از تشکيل شاخههاي نابجا و جانبي ميشوند. در بيشتر موارد اکسينها رويانزايي را در کشتهاي تعليق سلولي تحريک مينمايند. در غلظت کم اکسين، تشکيل ريشههاي نابجا حالت غالب دارد، در حالي که در غلظت زياد، اغلب اوقات ريشه تشکيل نشده و پينهزايي صورت ميگيرد. ايندول بوتيريک اسيد (IBA)، نفتالين استيک اسيد (NAA)، ايندول استيک اسيد (IAA)، 2و4- دي کلرو فنوکسي استيک اسيد (D-4،2) و 4- آمينو- 3، 5 و 6 تري کلرو پيکو لينيک (پيکلورام) از انواع اکسينهاي مورد استفادهاند (باقري و صفاري، 1376). پيريک (1987) اشاره کرد که NAA اکسين قوي است و در غلظتهاي نسبتاً پايين، ريشهزايي و در غلظتهاي بالا توليد کالوس مينمايد.
سيتوکينينها غالباً براي تحريک رشد و نمو به کار ميروند. کينتين (Kn)، 6- بنزيل آدنين (BA)، 6- بنزيل آمينوپورين (BAP)، زآتين (Zt) و 2- اتيل آمينوپورين (2ip) از انواع متداول سيتوکينينها هستند. اين تنظيم کنندههاي رشد به ويژه اگر همراه با يک اکسين بکار روند باعث تحريک تقسيم سلولي ميشوند. غلظت بالاي سيتوکينين باعث تشکيل ساقه نابجا ميشود و عموماً از تشکيل ريشه ممانعت به عمل ميآورند. سيتوکينينها از طريق کمکردن غالبيت انتهايي، باعث تحريک تشکيل ساقه نابجا و تأخير در پيري ميشوند (باقري و صفاري، 1376).
2-3-1- تأثير تنظيم کنندههاي رشد گياهي در ريزازديادي ليسيانتوس
بررسيها نشان ميدهند در کشت درون شيشهاي ليسيانتوس با توجه به اهدافي که مدنظر بوده به ترتيب از اکسينهاي NAA و IBA بيشتر استفاده شده است. از سيتوکينينها نيز اغلب BA و Kn مدنظر بوده است. در مجموع از نتايج آزمايشهاي انجام شده چنين بر ميآيد که کاربرد اکسين NAA به همراه سيتوکينين BA و برهم کنش ميان آنها در مقايسه با ساير تنظيم کنندههاي رشد نتايج مطلوبتري در کشت درون شيشهاي گونه مورد مطالعه ليسيانتوس داشته است. وتاکنون دررابطه بااستفاده ازغلظتهاي مختلف اکسين 2و4- دي کلرو فنوکسياستيکاسيد (D-4،2) و سيتوکنين 6- بنزيل آمينوپورين (BAP) تحقيقات چنداني صورت نگرفته است و به دليل کمبود منابع در اين زمينه در ادامه علاوه به بررسي موارد استفاده اکسين 2و4- دي کلرو فنوکسياستيکاسيد (D-4،2) و سيتوکنين 6- بنزيل آمينوپورين (BAP) در ريز ازديادي ليسيانتوس و گياهان زينتي ديگر به استفاده از ساير هورمونها در اين زمينه نيز اشاره خواهد شد.
2-4- اثر نوع ريزنمونه
2-4-1- ريزنمونه ساقه
در مطالعه و بررسيهاي مقدماتي که بر روي روش تکثير گياه روگ جنتين37 از خانواده جنتياناسه انجام شد، ريزنمونه ساقه ضدعفونيشده با کلريد جيوه يک درصد در محيط کشت پايهMB {ترکيبي از عناصر ماکرو از محيط کشت موراشيک و اسکوگ (MS)، عناصر کمياب و اصلي از محيط (B5) و آهن} به همراه IBA، 6-BA و جيبرليک اسيد38 با غلظتهاي (0، 5/0 و 2 ميليگرم در ليتر) بيشترين سرعت تکثير و القاي جوانه را داشت (يونگهوي و همکاران، 2008).
2-4-2- ريزنمونه برگ
در آزمايشي براي بررسي باززايي جوانه نابجا و ريزازديادي ليسيانتوس با کشت ريزنمونه برگ در محيط کشت MS، ازغلظت 1 ميليگرم در ليتر BA براي تشکيل شاخساره نابجا و از غلظتهاي 05/0 و 1/0 و ميليگرم در ليتر NAA و BA براي رشد گياهچه استفاده شد. در ضمن بهترين محيط کشت براي ريشهزايي گياهچه، محيط کشت MS همراه با 1/0 ميليگرم در ليتر IAA گزارش شد (کيدونگ و همکاران، 2003). از غلظت 1-5/0 ميليگرم در ليتر BA به همراه 2/0 ميليگرم در ليتر NAA و از BA با همان غلظت به همراه 2/0 ميليگرم در ليتر IBA براي القاي کالوسها از قطعات برگ ليسيانتوس در محيط کشت MS استفاده شد و غلظت بيش از 1 ميليگرم در ليتر BA باعث شيشهاي شدن گياه شد. در محيط کشت MS داراي 2-1 ميليگرم در ليترKn و 2/0 ميليگرم در ليتر NAA يا از همان غلظت Kn و 2/0 ميليگرم در ليتر IBA، افزايش سرعت القاي کالوس و تمايزيابي بهتر بافت حاصل شد. در مرحله نهايي اين آزمايش باززايي، ريشه به تعداد زياد روي محيط کشت مايع با نصف غلظت نمکهاي MS به همراه 50 گرم در ليتر سوکروز و 2 ميليگرم در ليترIBA اتفاق افتاد و افزايش باززايي ريشه منوط به محتوي محيط کشت آنها گزارش شد (کيون و همکاران، 2004(. در آزمايشي ديگر که بر روي باززايي ليسيانتوس از ريزنمونه برگ صورت گرفت، تمايزيابي جوانه را در محيط کشت MS حاوي 5/0 و 01/0 ميليگرم در ليتر Zt و NAA با pH به ميزان 3/6 و شدت روشنايي 60 ميکرومول بر متر مناسب دانستند و ريشهزايي مطلوب جوانه در محيط کشتي با نيمي از غلظت نمکهاي محيط کشت MS و غلظت بهينه 1 ميلي گرم در ليتر IBA گزارش شد (يوآنگرونگ و همکاران، 2004). در آزمايشي که بر روي ريزنمونههاي برگ دانهالهاي ايزوله شده ليسيانتوس انجام شد، در محيط کشت پايه SP با غلظتهاي 2، 4 و 8 ميکرومول پيکلورام، توليد کالوس و در محيط فاقد پيکلورام، کالوس توليد نشد و بهمنظور جوانهزني کالوسها و ريشهزايي، به محيط کشت با 5/1 ميکرومول BAP منتقل شدند. افزايش ريشهزايي با 5/2 ميکرومول IBA پس از 40 روز حاصل شد (باروت سيد و تيکسيرا، 2006). جهت باززايي مستقيم جوانه و رويانزايي بدني از ريزنمونه برگ ليسيانتوس، پس از گذشت چهار هفته، باززايي جوانه روي محيط کشت MS داراي Zt يا غلظت کم 1 ميليگرم در ليتر 2ip، شاخساره حاصل شد (روفوني و همکاران، 1990). در پژوهشهايي که بر روي ريزازديادي ليسيانتوس انجام شد، تمايزيابي جوانه و القاي کالوس از کشت ريزنمونه برگ ليسيانتوس در محيط کشت MS حاوي 5/0-1/0 ميليگرم در ليترBA و 05/0 ميليگرم در ليتر NAA اتفاق افتاد. همچنين در محيط کشت داراي 1/0 ميليگرم در ليتر BA و 05/0-02/0 ميليگرم در ليتر NAA ريزازديادي رخ داد و به منظور توليد ريشه نابجا کشت در محيطي با نيمي از غلظت نمکهاي محيط کشت MS به همراه 1-5/0 ميليگرم در ليترIBA صورت گرفت (ژوهوآ و همکاران، 2009). در آزمايشي، محققان باززايي ضعيف ريزنمونه برگ ليسيانتوس را در محيط کشت MS با 1 ميليگرم در ليتر IAA به دست آوردند و سرعت رشد کالوس در محيط کشت MS با 2 و 1 ميليگرم در ليتر NAA و D-4،2 نتايج مطلوبي در سرعت باززايي داشت (اسکرزيپکزاک و همکاران، 1993). روفوني و همکاران (1990) در آزمايشات خود در محيط کشت MS با غلظتهاي بالاي 2ip توليد مستقيم جوانه از ريزنمونه برگ ليسيانتوس را گزارش کرده و نشان دادند که افزايش غلظت NAA، کاهش ريشهزايي و افزايش کالوس را به همراه داشت.
2-4-3- ريزنمونه پروتوپلاست
بر اساس يک مطالعه در سال 1993 که بر روي باززايي پروتوپلاست پنج رقم ليسيانتوس انجام شد، پروتوپلاستهاي ايزوله شده حاصل از برگ يا لپهها در محيط کشت مايع v-km که شامل آگار و تنظيم کنندههاي رشد NAA و Zt با غلظت 37/5 و 28/2 ميکرومول در ليتر نگهداري و سپس ريزکالوسهاي رشد يافته به قطر 1 ميلي متر به محيط کشت حاوي 1/0 و 44/4 ميکرومول IBA وBAP منتقل کردند و طي چند دوره بازکشت شدند. توانايي باززايي پروتوپلاستها وابسته به مقدار کلسيم و تنظيم کنندههاي رشد در کشت درون شيشهاي گزارش شد. در مرحله نهايي نتايج، مطلوبي در ريشهزايي در محيط کشت MS داراي 71/5 ميکرومول IAA بهدست آمد (اوبرين و ليندساي، 1993). در مطالعهاي که برروي ريزنمونه مزوفيل پروتوپلاست برگ ليسيانتوس انجام شد، پروتوپلاستهاي ايزوله شده پس از سپري نمودن 30 روز از کشت بعد از توليد کالوس و باززايي جوانه، به منظور توليد ريشه به محيط کشتي با نيمي از غلظت نمکهاي محيط کشت MS به همراه 5/0 ميليگرم در ليتر IBA بازکشت شدند (کونيتاک و همکاران، 1995).
2-4-4- ريزنمونه ميانگره
در پژوهشي که روي تأثير اکسين و سيتوکينين با غلظتهاي مختلف و اثرات متفاوت رشد دو گونه ليسيانتوس انجام شد، در محيط کشت MS به همراه 5/0 و 1 ميليگرم IAA و Kn، ريزنمونههاي ميانگره گونه اگزاکوم افاين39 توليد کالوس ترد و ريزنمونههاي ليسيانتوس توليد کالوس نرم داشتند. همچنين هر دو گونه توليد کالوس ترد در محيط کشت MS حاوي 2-1 ميليگرم در ليتر D-4،2 و 1/0 و 1 ميليگرم در ليتر Kn نمودند. سپس کالوسهاي اگزاکوم افاين به محيط MS حاوي 01/0 و 02/0 ميليگرم در ليتر IAA و 1 ميليگرم در ليتر Kn و کالوسهاي ليسيانتوس به محيط کشت MS با 2 ميليگرم در ليتر Kn براي توليد جوانههاي خوشهاي منتقل شدند (باللال و همکاران40، 1990).
2-4-5- ريزنمونه نوک شاخساره
سمنيوک و گريسباخ (1987) در آزمايشات خود روي ريزازديادي ليسيانتوس، بيشترين تعداد شاخه را از ريزنمونه نوک شاخساره در محيط کشت MS با و 2/0 و 3 ميليگرم در ليتر NAA و BA گزارش کردند. پايک و هاهن (2000) در آزمايشات خود روي ريزنمونه نوک شاخساره در محيط کشت MS حاوي 23/23-49/13 ميکرومول BA و 2/22-32/13 ميکرومول Kn نتايج مطلوبي را در سرعت تشکيل جوانه در غلظتهاي بالا گزارش کردند و اين صفت منفي آبدار بودن جوانه را در پي داشت، و نيز نشان دادند که کينتين در غلظت بالا هايپرهيدريسيتي41 را تحريک ميکند.
2-4-6- ريزنمونه جوانه نابجا
باززايي رضايتبخش از ريزنمونههاي جوانههاي نابجا در محيط کشت MS با غلظتهاي 1 و 2 ميليگرم در ليتر NAA و BA رخ داد و باززايي ضعيف در محيط کشت MS حاوي 1 و 2 ميليگرم در ليتر IAA و Kn بهدست آمد (اسکرزيپکزاک و همکاران ، 1993).
2-4-7- ريزنمونه جوانه جانبي و انتهايي
در پژوهشي از 2 ميليگرم در ليتر IAA و Kn و يا 5/0 ميلي گرم در ليتر Zt به تنهايي نتايج خوبي در ريزازديادي ليسيانتوس از ريزنمونههاي جوانه جانبي و انتهايي و برگ گزارش شد. بيشترين تعداد جوانههاي نابجا در محيط کشت MS با افزودن 1 ميليگرم در ليتر BA به دست آمد (اسکرزيپکزاک و همکاران،1993). پژوهشهايي که برروي باززايي جوانه جانبي ليسيانتوس انجام گرفت بهترين محيط کشت براي فعال نمودن جوانه جانبي، محيط کشت گامبورک (B5) حاوي 1 ميليگرم در ليتر هورمونهاي BAP و GA گزارش شد و با انتقال نوساقهها به محيط کشت B5 به همراه 5/1 ميليگرم در ليتر NAA بيشترين طول، تعداد و درصد ريشهزايي به دست آمد (موسوي و همکاران، 1389).
2-4-8- ريزنمونه ريشه
فوکاي و همکاران (1991) در آزمايشاتي تأثير هورمونهاي گياهي را در تشکيل جوانه نابجا، متفاوت و وابسته به نوع ريزنمونه در گياه ليسيانتوس گزارش کردند. رشد مريستم انتهايي ريز نمونه ريشه دانهالهاي ليسيانتوس در محيط کشت عاري از اکسين مطلوب و رشد سرآغازههاي ريشهنامطلوب بود. در غلظتهاي بالاي اکسين، افزايش وزن تر و تعداد ريشههاي جانبي و کاهش توسعه ريشههاي جانبي بهدست آمد، و نيز مشاهده



قیمت: تومان


پاسخ دهید